干扰B7-H4表达通过下调E2F家族相关转录因子抑制乳腺癌细胞的增殖

陈昊川，郜赵伟，龙敏，刘冲，董轲，张惠中（空军军医大学第二附属医院 检验科，陕西 西安 710038）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，其发病率远高于肺癌和结直肠癌，是女性癌症死亡的首要原因[1]。乳腺癌的发病机制复杂，影响因素多，研究其发生和发展的分子机制对乳腺癌的早期诊断和治疗具有重要意义。共抑制分子B7-H4是B7家族的重要成员，在肿瘤、炎症和自身免疫性疾病中异常表达[2-3]，其在肿瘤发生和发展过程中发挥着极其重要的作用。B7-H4 通过抑制T 细胞增殖和细胞因子分泌，负调控T 细胞免疫反应，促进肿瘤细胞免疫逃逸[4]。研究结果[5]显示，B7-H4 在多种类型肿瘤中高表达，可作为肿瘤诊断的生物标志物，与肿瘤的不良预后和高复发率密切相关。然而，目前B7-H4在乳腺癌发生和发展中的作用及其机制尚未完全阐明。本研究以乳腺癌细胞T47D和MCF-7为研究对象，使用siRNA干扰B7-H4的表达，通过体外实验探究B7-H4对两种乳腺癌细胞增殖、凋亡、周期以及相关下游分子表达的影响，明确B7-H4与乳腺癌细胞恶性生物学行为之间的关系，为揭示B7-H4在乳腺癌发生和发展中的作用及其机制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 细胞系及主要试剂

人乳腺癌细胞系T47D和MCF-7购自武汉普诺赛生命科技有限公司。DMEM培养液购自美国Gibco公司，胎牛血清购自Excell Bio公司，LipofectamineTM2000试剂盒购自Invitrogen公司，TRIzol试剂购自TaKaRa公司，逆转录试剂盒购自奥科生物有限公司，qPCR试剂购自Abm生物科技有限公司，引物由西安擎科泽西生物技术有限公司合成，BCA蛋白定量试剂盒购自北京鼎国昌盛公司，SDS-PAGE凝胶试剂、RIPA裂解液购自碧云天生物技术有限公司，鼠抗人B7-H4单克隆抗体购自Proteintech公司，鼠抗人β-actin单克隆抗体、HRP标记的山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG二抗均购自北京中杉金桥公司，兔抗cyclin D1抗体（ab16663）购自Abcam公司，CCK-8细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物公司。siRNA由上海生工生物工程有限公司合成。siB7-H4 序列：正义链为5'-GCU CUACAAUGUUACGAUCAATT-3'，反义链为UUG AUCGUAACAUUGUAGAGCTT；siNC序列：正义链为5'-UUCUCCGAACGUG UCACGUTT-3'，反义链为5'-ACGUGACACG UUCGGAGAATT-3'。

1.2 细胞培养、转染和分组

乳腺癌T47D和MCF-7细胞均在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。转染前一天按照3×105个/孔（MCF-7细胞）或4×105个/孔（T47D细胞）接种于6孔板。根据LipofectamineTM2000使用手册将siRNA（siB7-H4）及其阴性对照（siNC）转染至MCF-7和T47D细胞，分别命名为T47D-siNC、T47D-siB7-H4、MCF-7-siNC、MCF-7-siB7-H4 组。每孔脂质体5 μL、siRNA 100 pmol/L（opti-MEM稀释），继续培养6 h后更换为DMEM完全培养基。

1.3 qPCR法检测乳腺癌细胞中B7-H4、cyclin D1和E2F家族相关转录因子mRNA的表达

收集转染48 h 后的各组细胞，用TRIzol 提取各组细胞总RNA，并逆转录为cDNA，以β-actin 为内参，进行qPCR实验比较目的基因mRNA表达水平差异变化。引物序列见表1。qPCR 反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火和延伸1 min，共40个循环。以β-actin为参照，采用2-ΔΔCT法计算各目的基因mRNA的相对表达量。

表1 qPCR引物序列

1.4 WB法检测乳腺癌细胞中B7-H4和cyclin D1蛋白的表达

收集转染48 h 后的各组细胞，PBS 清洗后，加入含1%PMSF 的RIPA 裂解液，提取细胞总蛋白，并用BCA 法测定蛋白浓度。取20 μg 蛋白样品进行SDS-PAGE，将蛋白质转移至NC 膜上，在5%脱脂奶粉中4 ℃封闭过夜。次日，加入鼠抗人B7-H4抗体（1∶500）、兔抗人cyclin D1 抗体（1∶200）、鼠抗人β-actin 抗体（1∶1 000），室温中处理2 h。TBST洗涤3次（10 min/次），后用HRP 标记的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG 二抗（1∶5 000）室温孵育2 h，TBST 洗涤后，加入电化学发光液通过自动呈像仪（Bio-Rad 公司）显影，采用ImageJ软件分析蛋白条带的灰度值。

1.5 CCK-8法检测乳腺癌细胞的增殖能力

将各组细胞接种于96 孔培养板中，其中MCF-7-siNC 和MCF-7-siB7-H4 为5×103个细胞/孔，T47D-siNC 和T47D-siB7-H4 为7.5×103个细胞/孔，每孔加100 μL培养基，每组设5个复孔，继续培养，分别在24、48、72 h时将10 μL CCK-8溶液加入培养孔中，继续培养2 h后上酶标仪450 mm波长处检测每孔的光密度（D）值，以D值代表细胞增殖水平。

1.6 FCM检测乳腺癌细胞的凋亡水平和细胞周期

转染细胞培养48 h后，经胰酶消化并收集细胞，PBS 洗涤2 次，弃上清液。利用Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒处理细胞：用500 μL 结合缓冲液悬浮细胞，加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和5 μL PI，混匀，室温下避光处理15 min，1 h 内上流式细胞仪检测。利用细胞周期检测试剂盒处理细胞：用500 μL 75%乙醇固定细胞2 h，PBS 洗涤2 次后，加入450 μL PI 和50 μL RNaseA，混匀后室温避光处理30～60 min，上流式细胞仪分析细胞的周期分布情况。

1.7 统计学处理

qPCR 法、WB 法、CCK-8 法、FCM 等实验均重复3 次。采用SPSS 21.0 统计软件对数据进行统计分析，符合正态分布的计量数据以表示，两组间比较采用独立样本t检验和近似t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，以P＜0.05 或P＜0.01 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成功构建干扰B7-H4表达的T47D和MCF-7细胞

qPCR 法和WB 法检测结果（图1）显示，与T47D-siNC 和MCF-7-siNC 组相比，T47D-siB7-H4、MCF-7-siB7-H4 组细胞中B7-H4 mRNA 和蛋白表达水平均显著下降（均P＜0.01）。结果表明，通过转染特异性siRNA，成功构建干扰B7-H4 表达的乳腺癌T47D和MCF-7细胞系，可以进行后续实验。

2.2 干扰B7-H4 表达显著抑制T47D 和MCF-7 细胞的增殖能力

CCK-8法检测结果（图2）显示，T47D-siB7-H4组细胞增殖能力显著低于T47D-siNC 组（P＜0.01）；MCF-7-siB7-H4 组细胞增殖能力显著低于MCF-7-siNC 组（P＜0.01）。结果表明，干扰B7-H4 表达显著抑制了乳腺癌T47D 和MCF-7 细胞的增殖能力。

2.3 干扰B7-H4 表达可使T47D 和MCF-7 细胞发生G1/S期阻滞

FCM 检测结果显示，与T47D-siNC 组相比，T47D-siB7-H4 组细胞中处于G1 期细胞百分比显著增加[（73.05±3.52）%vs（66.55±1.17）%，P＜0.01；图3A]；与MCF-7-siNC 组相比，MCF-7-siB7-H4 组细胞中处于G1期细胞百分比显著增加[（67.56±1.85）%vs（56.68±0.31）%，P＜0.01；图3B]。结果表明，干扰B7-H4 表达可使乳腺癌T47D 和MCF-7 细胞发生G1/S期阻滞。

2.4 B7-H4表达下调抑制cyclin D1表达

WB实验结果（图4）显示，与T47D-siNC 和MCF-7-siNC组相比，T47D-siB7-H4和MCF-7-siB7-H4组细胞中cyclin D1 mRNA和蛋白表达水平均显著下降（均P＜0.01）。以上结果表明，干扰B7-H4 表达能够下调乳腺癌细胞cyclin D1的表达。

2.5 干扰B7-H4 表达对E2F 家族相关转录因子表达的影响

qPCR 法检测结果（图5）显示，与T47D-siNC组相比，T47D-siB7-H4组细胞中E2F1、E2F2、E2F7 和E2F8 mRNA 水平有不同程度的降低（均P＜0.01）；与MCF-siNC组相比，MCF-7-B7-H4组细胞中E2F1、E2F2、E2F3、E2F7和E2F8 mRNA 水平有不同程度的降低（P＜0.05 或P＜0.01）。其中，E2F1、E2F2、E2F7 和E2F8 为两细胞系干扰B7-H4 后共同下调的E2F 家族转录因子。

2.6 干扰B7-H4 表达对T47D 和MCF-7 细胞的凋亡无影响

FCM检测结果（图6）显示，与T47D-siNC 和MCF-7-siNC组相比，T47D-siB7-H4和MCF-7-siB7-H4组细胞的凋亡率差异无统计学意义（均P＞0.05）。结果表明，干扰B7-H4 表达对乳腺癌T47D 和MCF-7 细胞的凋亡无显著影响。

3 讨论

B7-H4与B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、B7-H1/PD-L1（CD274）、ICOS-L/B7-H2（CD275）、B7-H3（CD276）等同属B7家族成员，在多种肿瘤的发生与发展中起重要作用。B7-H4在宫颈癌、食管癌、黑色素瘤、尿路上皮细胞癌、肾细胞癌、非小细胞肺癌和肝癌等多种肿瘤中均有异常表达[6]，且在几乎所有乳腺浸润性导管癌和小叶乳腺癌中高表达[7]。B7-H4与宫颈癌患者总生存期和无病生存期呈负相关，在卵巢癌患者血清中水平升高，是一种有应用前景的卵巢癌标志物[8-10]。HAO等[11]的研究结果显示，抑制B7-H4通过激活PI3K信号通路促进肝细胞癌细胞凋亡和自噬。作为B7家族的成员，研究者常聚焦于其在肿瘤微环境中所扮演的免疫抑制角色。B7-H4的过表达通过上调CXCL8募集肿瘤相关嗜中性粒细胞促进肾细胞癌进展[12]，并且与转移性结直肠癌中免疫细胞浸润和不良预后相关[13]。DANGAJ等[14]认为，阻断B7-H4和受体相互作用是一种可行的肿瘤治疗策略，然而B7-H4的受体分子仍不明确[3]。在肿瘤治疗中，针对B7-H4 已经开发了几种策略，包括抗体、CAR-T细胞和药物偶联物等。由于在三阴性乳腺癌组织中存在较高水平的PD-L1[15]，因此抑制B7-H4糖基化可与化疗和PD-L1阻断相结合，从而控制肿瘤细胞增殖[16]；抗B7-H4协同曲妥珠单抗治疗可促进巨噬细胞吞噬作用并根除乳腺癌[17]。据报道[18]，B7-H4是一种不稳定的细胞表面抗原，可能不适合作为抗体依赖的细胞毒性或单克隆抗体药物的靶点。因此，对B7-H4在肿瘤发生与发展中的作用及机制研究可以为免疫治疗药物的研发提供新的思路和途径。

本文利用特异性靶向B7-H4 的siRNA 成功干扰了乳腺癌MCF-7和T47D细胞中B7-H4的表达，研究结果显示，干扰B7-H4 的表达后，MCF-7 和T47D 细胞的增殖受到显著抑制，发生G1/S 期阻滞并伴有cyclin D1 表达的降低，这与在肝癌[19]、结直肠癌[20]、胃癌[21]中的研究报道一致。此外，本实验中干扰B7-H4表达后对2种乳腺癌细胞的凋亡无显著影响，这与之前其他研究报道不符，如干扰B7-H4表达可以促进胃癌MGC-803 细胞[21]和结直肠癌HT-29 细胞凋亡[20]。B7-H4作为肿瘤微环境中的免疫抑制因子，可通过抑制肿瘤微环境中的CD8+T细胞的抗肿瘤作用来帮助肿瘤细胞发生免疫逃逸，从而促进肿瘤的发生发展。本研究中，干扰的是乳腺癌细胞自身B7-H4 的表达，在体外培养环境中无法体现干扰B7-H4 表达对乳腺癌细胞肿瘤微环境中浸润的免疫细胞的影响，如CD8+T 细胞诱导的肿瘤细胞凋亡，这可能是本实验中干扰B7-H4对乳腺癌细胞凋亡无直接影响的原因，也表明B7-H4的作用存在肿瘤特异性，即在不同类型肿瘤中的作用不一致，因此针对B7-H4在乳腺癌中的作用及其机制需要更广泛的研究。

细胞异常增殖是恶性肿瘤的重要特征之一，若无有效控制，肿瘤细胞会逐渐侵犯和破坏其周围的组织和器官，并向远处组织器官转移[22]。乳腺癌是由乳腺上皮细胞发生增殖失控、进而恶变形成，是全世界女性最常见的恶性肿瘤。细胞增殖涉及受到高度调控的一系列事件，在此过程中细胞中的遗传信息被复制并最终分裂成两个子细胞。标志着细胞从G1期向S 期过渡的最关键事件是E2F 家族相关转录因子调控的转录程序的激活[23]，在G1末期，E2F家族的成员会刺激数百个基因的表达，促进DNA复制，并促进细胞周期的不可逆进程[24]。E2F 家族由8 个成员（E2F1～8）组成，成员可分为转录激活因子和转录抑制因子。E2F1和E2F2是转录激活因子，他们驱动基因表达促进细胞从G1 期有序过渡到S 期，从而促进细胞增殖；E2F7 和E2F8 虽被归类为“抑制型”E2F 成员，但与经典的E2F 家族抑制因子不同，他们的表达与细胞的高增殖率相关[25]。本实验中干扰乳腺癌细胞B7-H4 的表达后，MCF-7 和T47D 细胞中E2F1、E2F2、E2F7、E2F8 mRNA 表达水平都有不同程度的下调。不论是E2F家族的转录激活因子成员E2F1和E2F2还是E2F家族非典型抑制成员E2F7和E2F8，他们表达水平的下降与干扰B7-H4 表达导致的细胞周期阻滞及细胞增殖抑制的现象相一致。该结果为进一步探索B7-H4 在乳腺癌发生与发展的具体机制提供了研究方向，为下一步研发针对B7-H4的新治疗方式奠定了初步实验基础。

综上所述，B7-H4无论是通过间接参与免疫调控亦或是直接促进肿瘤细胞进展，都表明它是肿瘤发生与发展中的重要分子，干扰B7-H4 表达可下调cyclin D1和E2F家族相关转录因子的表达，导致乳腺癌细胞的细胞周期阻滞，并抑制细胞增殖，对其凋亡无显著影响。此研究为后续B7-H4 在乳腺癌的诊断和治疗中的应用提供了实验依据。当然，本实验的研究结果仍需进一步进行体内实验验证。