环状RNA_000926通过靶向miR-411-5p调控宫颈癌细胞的增殖和凋亡

王娜，张霞，李淼，张华林，王玉净（河北医科大学第一医院 妇科，河北 石家庄 050000）

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年大约有53万新发病例和27万死亡病例[1]。持续性人乳头瘤病毒感染是宫颈癌的主要发病原因。随着医疗技术的进步，接受手术、放射与化学治疗患者的5 年总生存（OS）率达80%，复发患者的5 年OS 率低于50%[2]。因此，需要更深入地了解宫颈癌发生和发展的病理机制来寻找新的治疗靶点，以改善患者预后。环状RNA（circular RNA,circRNA）是一类内源性非编码RNA，circRNA 的结构是一个独特的闭环，因此，在各种生物学过程中不易降解和稳定表达。研究结果[3-4]发现，circRNA在多种类型恶性肿瘤中起重要作用。circ_000926 在肾细胞癌中高表达，并通过下调其表达可抑制肾细胞癌细胞的增殖、迁移与侵袭能力[5]。然而，circ_000926在宫颈癌中的作用及其机制尚不清楚。miRNA 是小的单链RNA，其长度为20～25个核苷酸，可作为基因调控的关键功能因子[6]。miR-411-5p 能够抑制宫颈癌细胞增殖，并促进细胞凋亡[7]，但其在宫颈癌中表达失调的机制尚未明了。本研究通过检测宫颈癌组织和细胞中circ_000926 和miR-411-5p 表达水平，通过体外实验探讨过表达或沉默circ_000926对宫颈癌细胞增殖与凋亡的影响及其作用机制，为寻求宫颈癌特异性靶向治疗方法提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 组织标本、细胞及主要试剂

收集2019年5月至2020年9月在河北医科大学第一医院手术切除的30例宫颈癌患者的癌及癌旁组织标本，所有组织标本均经过病理学诊断。组织标本收集后，立即保存于-80 ℃液氮中。所有患者术前均告知并签署知情同意书，研究方案征得医院医学伦理委员会的批准。人宫颈癌细胞HeLa和SiHa和正常宫颈细胞Ect1/E6E7均购自美国模式培养物集存库。DMEM培养基、LipofectamineTM2000 转染试剂盒、TRIzol试剂、PCR逆转录试剂盒均购自美国Invitrogen 公司，双荧光素酶载体、circ_000926 过表达质粒和空白质粒、circ_000926小干扰RNA和阴性对照寡核苷酸、miR-411-5p模拟物（mimic）及其阴性对照购自上海吉玛公司，CCK-8试剂、RIPA裂解液、BCA蛋白试剂盒、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天公司，细胞核增殖抗原标志物Ki67抗体（ab15580）、BAX 抗体（ab32503）、Caspase-3抗体（ab32351）和Caspase-9抗体（ab32539）、β-actin抗体（ab8227）及羊抗兔IgG（ab6721）均购自英国Abcam公司。

1.2 细胞培养、转染及分组

将所有细胞在含有10%胎牛血清和1%链霉素的DMEM 培养基中培养，于37 ℃、5%CO2的培养箱中常规培养，每3 d更换1次培养液，直到细胞达到对数生长期。

按照LipofectamineTM2000 转染试剂盒说明将circ_000926 过表达质粒和空白质粒（pc-NC）、circ_000926 小干扰RNA 和阴性对照寡核苷酸（si-NC）、miR-411-5p mimic 和阴性对照（miR-NC）分别转染至HeLa和SiHa细胞，实验分为pc-circ_000926组、pc-NC组、si-circ_000926组、si-NC组、miR-411-5p mimic 组和miR-NC 组。转染48 h 后，采用qPCR 检测转染效率，转染成功后，方可进行后续实验。

1.3 qPCR 法检测宫颈癌组织和细胞中circ_000926和miR-411-5p的表达

用TRIzol 试剂提取组织和细胞中总RNA，并逆转录成cDNA，后采用SYBR-Green PCR 试剂和ABI7500FAST Real-Time PCR 仪进行实时荧光定量PCR（qPCR）。引物序列：circ_000926 上游为5′-TTG TGCTTTCTGGAGGGTCT-3′，下游为5′-GCACAA ATAAACCCCACATTTT-3′；miR-411-5p上游为5′-TCGCTGTAGTAGACCGTAT-3′，下游为5′-GCACCT CAGGCTTGTACC-3′；GAPDH上游为5'-GAAGGT GAGGTCGGAGTC-3'，下游为 5'-GAAGAGTGG ATGGGATTC-3'；U6 上游为5'-GCTTCGGCAGCA CATATACTAA-3'，下游为5'-GCTTCACAATTTGC GTGTCAT-3'。qPCR 反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s，共35个循环。以GAPDH和U6为内参，通过2-△△Ct方法计算circ_000926和miR-411-5p的相对表达量。

1.4 CCK-8法检测宫颈癌细胞的增殖活力

将对数生长期的各组转染细胞接种于96 孔板（2×103个细胞/孔），待细胞贴壁后加入20 μL CCK-8试剂，在37 ℃、5%CO2环境下继续培养，分别在培养24、48、72 和96 h 时，用酶标仪检测在450 nm 波长处各组细胞的光密度（D）值，并绘制细胞增殖曲线。

1.5 TUNEL法检测宫颈癌细胞的凋亡水平

将各组孔细胞接种在1 cm×1 cm 的玻片上，置于24孔板中，PBS洗涤3次。加入4%多聚甲醛固定30 min，PBS 洗涤1 次。根据制造商说明，使用TUNEL 细胞凋亡检测盒试剂进行染色，37 ℃避光处理1 h，PBS洗涤3次。用抗荧光淬灭封片液封片后，在荧光显微镜下观察，随机选取5个视野，通过计算TUNEL阳性细胞核数量占DAPI染色核数量的比例，计算凋亡细胞数的百分比。

1.6 双荧光素酶报告基因实验验证circ_000926 与miR-411-5p之间的靶向关系

通过在线网站StarBase 预测circ_000926 与miR-411-5p 之间存在互补的结合位点。使用LipofectamineTM2000 将circ_000926-野生型（WT）和circ_000926-突变型（MUT）报告基因质粒分别与miR-411-5p mimic、miR-NC共转染至HeLa细胞，48 h后，按照试剂盒说明书方法，在Dual-Luciferase®Reporter Assay System上测定转染细胞的荧光素酶活性。

1.7 WB法检测宫颈癌细胞中Ki67、BAX、Caspase-3和Caspase-9蛋白的表达水平

用RIPA裂解缓冲液提取细胞中总蛋白，使用BCA法对蛋白进行定量，进行10%SDS-PAGE，将分离的蛋白质转移至PVDF 膜上，10%脱脂牛奶中封闭2 h，加入Ki67（1∶1 000）、BAX（1∶1 000）、Caspase-3（1∶1 000）、Caspase-9（1∶1 000）和β-actin（1∶500）一抗，4 ℃过夜培养。TBST洗膜后，在羊抗兔二抗（1∶2 000）中处置1 h后，使用ECL电化学发光法显影。采用ImageJ图像分析软件分析目的蛋白条带的灰度值，以β-actin作为内参对照计算蛋白相对表达量。

1.8 统计学处理

qPCR法、CCK-8法、TUNEL法和WB法等实验均独立重复3次。采用SPSS 22.0统计软件对实验数据进行统计分析，以GraphPad Prism8.0软件作图。符合正态分布的计量资料以表示，两组间差异比较采用t检验，多组间差异比较采用单因素方差分析，以P＜0.05或P＜0.01表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌组织和细胞中circ_000926 高表达、miR-411-5p低表达

qPCR法检测结果（图1）显示，与癌旁组织相比，宫颈癌组织中circ_000926 表达水平显著升高、miR-411-5p表达水平显著降低（均P＜0.01）；与Ect1/E6E7 细胞相比，HeLa和SiHa细胞中circ_000926表达水平均显著升高、miR-411-5p表达水平均显著降低（均P＜0.01）。结果表明，宫颈癌组织和细胞中circ_000926显著高表达、miR-411-5p显著低表达。

2.2 干扰circ_000926对HeLa和SiHa细胞增殖的影响

qPCR检测结果显示，与pc-NC组相比，pc-circ_000926组HeLa 和SiHa 细胞中circ_000926 表达水平均显著升高（2.89±0.28vs1.06±0.13，2.97±0.23vs0.97±0.16；均P＜0.01）；与si-NC 组相比，si-circ_000926 组HeLa 和SiHa 细胞中circ_000926 表达水平均显著降 低（0.34±0.08vs0.93±0.17，0.41±0.05vs1.02±0.10；均P＜0.01）。CCK-8 法检测结果（图2）显示，与pc-NC组相比，pc-circ_000926 组HeLa 和SiHa 细胞增殖活力显著增强（均P＜0.01）；与si-NC组相比，si-circ_000926 组HeLa 和SiHa细胞增殖活力均显著降低（均P＜0.01）。结果表明，过表达circ_000926 促进宫颈癌细胞增殖，敲减circ_000926则抑制宫颈癌细胞增殖。

2.3 过表达或敲减circ_000926 可抑制或促进HeLa和SiHa细胞凋亡

TUNEL 法检测结果（图3）显示，与pc-NC 组相比，pc-circ_000926 组HeLa 和SiHa 细胞凋亡率均显著降低（均P＜0.01）；与si-NC 组相比，si-circ_000926组细胞凋亡率均显著增高（均P＜0.01）。结果表明，过表达circ_000926 抑制宫颈癌细胞凋亡，敲减circ_000926则促进宫颈癌细胞凋亡。

2.4 circ_000926靶向负向调控miR-411-5p表达

通过在线网站StarBase预测发现，circ_000926与miR-411-5p之间存在互补的结合位点（图4A）。双荧光素报告基因实验结果（图4B）显示，与miR-NC组 相比，miR-411-5p mimic 与circ_000926-WT 共转染组细胞的荧光素酶活性显著降低（P＜0.01），而与circ_000926-MUT共转染组细胞的荧光素酶活性无变化（P＞0.05），表明miR-411-5p可以与circ_000926直接结合。qPCR法检测结果（图4C）显示，与pc-NC组相比，pc-circ_000926 组细胞中miR-411-5p 表达显著降低（均P＜0.01）；与si-NC 组相比，si-circ_000926组细胞中miR-411-5p表达显著升高（均P＜0.01）。实验结果表明，miR-411-5p 是circ_000926 的靶基因，circ_000926可负向调控miR-411-5p表达。

2.5 过表达或敲减circ_000926 对宫颈癌细胞中增殖与凋亡相关蛋白表达的影响

WB 法检测结果（图5）显示，与pc-NC 组相比，pc-circ_000926 组HeLa 和SiHa 细 胞 中Ki67 蛋白的表达显著升高（均P＜0.01），而BAX、Caspase-3 和Caspase-9蛋白的表达显著降低（均P＜0.01）；与si-NC组相比，si-circ_000926 组HeLa 和SiHa 细胞中Ki67蛋白的表达显著降低（均P＜0.01），BAX、Caspase-3和Caspase-9蛋白的表达显著升高（均P＜0.01）。结果表明，过表达circ_000926 可上调Ki67 蛋白的表达，并下调BAX、Caspase-3 和Caspase-9 蛋白的表达；敲减circ_000926表达后结果则相反。

2.6 过表达miR-411-5p 可逆转过表达circ_000926对宫颈癌细胞增殖、凋亡的作用

转染miR-411-5p mimic后，CCK-8法、TUNEL法和WB法检测结果显示，与pc-NC组相比，pc-circ_000926组HeLa 和SiHa 细胞增殖活性均显著增高（均P＜0.01，图6A）、细胞凋亡率均显著降低（均P＜0.01，图6B），Ki67蛋白的表达显著升高、BAX蛋白的表达显著降低（均P＜0.01，图6C）；与pc-circ_000926 组相比，pc-circ_000926+miR-411-5p mimic 组HeLa 和SiHa 细胞增殖活性显著降低（均P＜0.05，图6A）、细胞凋亡率显著升高（均P＜0.05，图6B），Ki67蛋白的表达显著降低、BAX 蛋白的表达显著增加（均P＜0.01，图6C）。结果表明，过表达miR-411-5p可逆转过表达circ_000926对宫颈癌细胞增殖和凋亡的作用。

3 讨论

宫颈癌是发展中国家女性发病率与病死率较高的恶性肿瘤之一，手术、放射治疗和化学治疗对于晚期宫颈癌患者的疗效并不理想[8]，亟待寻找新的治疗方法。circRNA 是稳定的RNA 分子，通常起着miRNA海绵的作用，以调节基因表达、参与不同的病理反应[9]，其可作为肿瘤诊断和预后评估的标志物及潜在的治疗靶点。

越来越多的证据表明，circRNA在包括宫颈癌在内的多种肿瘤中发挥重要作用。例如，circ_102002在甲状腺乳头癌中高表达，其通过靶向miR-488-3p/HAS2轴促进甲状腺乳头癌细胞的迁移和EMT[10]；circ_0000218通过靶向吸附miR-1182 促进宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭[11]；circRNA_400029 通过调控miR-1285-3p/TLN1轴促进宫颈癌的恶性生物学行为，并抑制细胞凋亡，下调circRNA_400029 可抑制裸鼠体内肿瘤生长[12]。据报道[5]，circ_000926 在肾细胞癌中上调，敲减circ_000926 通过靶向miR-411/CDH2 轴抑制肾细胞癌细胞的迁移、侵袭和EMT。本研究发现，circ_000926在宫颈癌组织和细胞中呈高表达，其可促进宫颈癌细胞增殖而抑制细胞凋亡。

miRNA 在细胞增殖、分化及凋亡过程中发挥重要的调节功能[13-14]。多数研究表明，miR-411-5p 在多数肿瘤中发挥抑癌基因的作用。例如，miR-411-5p在乳腺癌中下调，SNHG15 通过调节miR-411-5p/VASP轴促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，并抑制细胞凋亡[15]；miR-411-5p在前列腺癌中低表达，其通过靶向SMAD3/TGFBR2 抑制前列腺癌细胞增殖和侵袭，促进细胞凋亡，并抑制裸鼠体内肿瘤生长[16]。本研究通过生物信息学分析发现，miR-411-5p 与circ_000926序列间存在特异性结合位点，双荧光素酶报告基因实验结果证实circ_000926 与miR-411-5p 直接结合且负向调控miR-411-5p表达；此外，上调miR-411-5p表达可逆转过表达circ_000926对宫颈癌HeLa、SiHa细胞增殖、凋亡的影响。

综上所述，本研究证实circ_000926 能够通过靶向吸附miR-411-5p 促进宫颈癌HeLa 和SiHa 细胞的增殖，并抑制其凋亡，为宫颈癌治疗和预后提供了潜在靶点。未来还需进行体内实验，进一步验证本实验结论。