1种基于平板共培养筛选抗菌海洋放线菌的方法

刘姝+房耀维+王淑军+焦豫良+陈国强+潘建梅+金志勇

摘要：为开发1种基于共培养的抗菌性海洋放线菌平板高效筛选方法，并对菌株提高放线菌产抗菌物质能力的机制进行探索，以单独培养的海葵共附生放线菌为对照，研究与菌株共培养对海葵共附生海洋放线菌抗菌性菌株筛选效率的影响，以及不同生长期蜡样芽孢杆菌菌株Bacillus cereus AS1.1846的发酵液、发酵液添加量和添加时间对放线菌菌株AAA015抗菌活性的影响，初步探索提高放线菌抗菌活性的机制。结果表明，通过平板共培养可以显著提高抗菌性海洋放线菌筛选效率。B. cereus AS1.1846从稳定期开始分泌到胞外提高放线菌抗菌活性、对热稳定的次生代谢产物，少量的该物质即可显著提高菌株AAA015的抗菌活性。获得了1种基于共培养的高效抗菌活性海洋放线菌平板筛选方法。

关键词：平板；共培养；海洋放线菌；抗菌活性；筛选

中图分类号： S182文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）17-0254-05

收稿日期：2016-04-19

基金项目：国家自然科学基金（编号：31201687）；江苏省自然科学基金面上项目（编号：BK20141249、BK20151282）；江苏省海洋资源开发研究院开放课题（编号：JSIMR201422、JSIMR201506）；淮海工学院科研创新基金（编号：Z2014016）；江苏省高校“青蓝工程”。

作者简介：刘姝（1975—），女，江西南昌人，博士，副教授，主要从事海洋微生物资源开发与利用研究。E-mail：jdliushu@163.com。

通信作者：房耀维，博士，副教授，主要从事海洋微生物次级代谢产物研究。E-mail：foroei@163.com。抗生素在人类与植物病原微生物的斗争中起到了举足轻重的作用[1]。但是，由于抗生素的广泛使用乃至滥用，导致多重耐药菌（multidrug-resistant pathogens，简称MDR）出现并有蔓延态势，筛选新颖的抗菌活性物质用于生物农药的开发成为对抗多重耐药菌的主要方法之一[2-3]。不幸的是，尽管抗菌活性物质筛选技术、合成生物学以及化学修饰技术快速发展，但新型抗菌活性物质的发现速率却依然难以满足药剂市场的需求，导致公众健康仍然面临巨大威胁[4]。幅员辽阔、环境复杂多样的海洋蕴含种类、数量极其巨大的新颖抗菌活性物质[5]。研究表明，目前筛选获得的抗菌物质只是宝藏的冰山一角，更多的新颖抗菌活性物质有待研究者去开发[6]。因此，需要进一步开发快速的抗菌活性物质筛选技术。

传统的抗菌活性微生物筛选建立在单独培养的基础上。而自然情况下，微生物是杂居混生的，争夺营养和生存空间被认为是微生物产抗菌物质的主要诱因之一[7-8]，通过微生物共培养发酵可显著提高多种微生物产抗菌物质水平可以进一步对此进行佐证[9]。可见，单独培养降低了微生物产抗菌物质的可能性，不利于抗菌活性物质的筛选。模拟自然环境，基于共培养方式筛选产抗菌活性物质的微生物菌株，理论上具有更好的筛选潜在产抗菌物质微生物的能力。放线菌是微生物中产抗菌活性物质的佼佼者[10]。本研究以海葵共附生海洋放线菌为研究对象，拟开发1种基于平板共培养的筛选具有抗菌活性海洋放线菌的高效方法，对提高菌株抗菌活性的物质来源进行探索。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1样品采集连云港连岛海域（34°76′N，119°48′E）活黄海葵，样品置于无菌玻璃瓶内，立即放于冰盒保存，并尽快送回实验室进行处理。

1.1.2试验菌株蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus AS1.1846）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus AS1.2465）、大肠杆菌（Escherichia coli AS1.487）、啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae AS2.114）、巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris GS115）、扩展青霉（Penicillium expansum AS3.3703）、荧光假单胞菌（Pseudomouas fluorescens AS1.1802）、黑曲霉（Aspergillus niger AS3.350），来源于中国普通微生物菌种保藏中心。

1.1.3培养基海葵共附生放线菌分离培养基：天然海沙提取物（NRS提取物）90 mL，海葵提取物10 mL，海水900 mL，pH值自然。NRS提取物的制备：用500 mL海水清洗900 mL取自潮间带的海沙，4 ℃ 保存。海葵提取物的制备：活黄海葵10 g，加海水90 mL，高速匀浆后，8层纱布过滤，现配现用。培养基灭菌降温后添加放线菌酮、萘啶酮酸至终浓度分别为100、25 mg/L。指示菌和共培养菌培养基的配制：细菌和真菌分别采用营养琼脂培养基培养[11]和PDA培养基培养[11]，固体培养基添加2%琼脂。种子培养基为2216E培养基，发酵产抗菌物质培养基采用Zhang等报道的发酵培养基[12]。所有培养基均在1×105 Pa条件下灭菌20 min。

1.2平板共培养筛选抗菌性海葵共附生放线菌

如图1所示，从1 mL移液枪枪头扩口端剪下12 mm，制成塑料圆柱体，1×105 Pa灭菌20 min，备用。预共培养的菌株发酵活化后用三区划线法分离单菌落。在无菌条件下，将10 g湿海葵放入灭菌的铝合金盘子内，放置于超净台中24 h使样品干燥，再用研磨棒轻轻地将样品压成粉末。用直径为

14 mm的泡沫塑料棒轻压粉末作為印章，在固体培养基上依次影印8～9次，培养3～10 d至出现单菌落。根据放线菌菌落颜色、形状、大小以及简单染色后显微镜观察菌株基内菌丝、气生菌丝、孢子丝和孢子形态分辨不同放线菌，标记编号，并保存菌种。

分别吸取100 μL培养至对数生长期的E. coli AS1.487涂布平板，用于抗菌活性测定。将塑料圆柱体窄口端置于单菌落上，轻压至圆柱体接触皿底，取出后，将塑料圆柱体宽口端置于海葵共附生放线菌单菌落上，用镊子轻压窄口端琼脂，使圆柱中上下琼脂层接触，30 ℃共培养3 d后，将共培养圆柱体移至含菌平板上，用于抗菌活性筛选。以塑料圆柱体窄口端为无菌琼脂，宽口端为放线菌的单培养菌株为对照（CK）。培养2 d后，置于S. aureus AS1.2465、P. fluorescens AS1.1802、S. cerevisiae AS2.114以及P. expansum AS3.3703含菌平板上，30 ℃培养3 d后测定抑菌圈直径。endprint

1.3不同共培养菌株对3株放线菌产抗菌物质的影响

将S. aureus AS1.2465、B. cereus AS1.1846、E. coli AS1.487、P. fluorescens AS1.1802、P. pastoris GS115、S. cerevisiae AS2.114、P. expansum AS3.3703以及A. niger AS3.350分别与3株具有抗菌活性的放线菌菌株（编号分别为AAA015、AAA016和AAA162）共培养，以单培养的菌株为对照，置于不同供试菌平板上，30 ℃培养3 d后测定抑菌圈直径。

1.4不同处理形式的B. cereus AS1.1846菌体、发酵液的制备及抗菌活性测定

将斜面保藏的B. cereus AS1.1846接种至装有50 mL液体营养琼脂培养基的250 mL三角瓶中，30 ℃、160 r/min培养36 h。吸取10 mL发酵液，8 000 r/min离心5 min，上清液过0.22 μm的滤膜，记作无细胞上清液（cell-free supernatants，简称CFS）。量取1/2 CFS，沸水煮10 min，记作hs-CFS，称取湿质量0.1 g的菌体，用10 mL无菌生理盐水清洗3次后，重悬于10 mL无菌生理盐水中，冰水浴，超声波破碎菌体（400 W，超声3 s，停7 s，共超声10 min），镜检无完整细胞，记作SC，量取1/2 SC，1×105 Pa灭菌30 min，记作hs-SC。将塑料圆柱体宽口端置于无菌琼脂平板上，轻压至圆柱体接触皿底，取出后，在无菌条件下，分别向塑料圆柱体内加入 50 μL CFS、hs-CFS、SC、hs-SC，置于S. aureus AS1.2465、E. coli AS1.487、S. cerevisiae AS2.114以及P. expansum AS3.3703含菌平板上，30 ℃培養3 d后测定抑菌圈直径。

1.5不同处理形式的B. cereus AS1.1846菌体及发酵液对放线菌菌株AAA015、AAA016、AAA162产抗菌物质的影响

在海葵共附生放线菌分离培养基平板上采用三区划线法分离单菌落，塑料圆柱体宽口端置于单菌落上，轻压至圆柱体接触皿底，取出后，在无菌条件下，分别向塑料圆柱体内加入20 μL CFS、hs-CFS、SC和hs-SC，以未加入任何物质的菌株为对照，置于S. aureus AS1.2465、E. coli AS1.487、S. cerevisiae AS2.114、P. expansum AS3.3703含菌平板上，30 ℃培养3 d后测定抑菌圈直径。采用牛津杯法，利用菌株S. aureus AS1.2465、E. coli AS1.487、S. cerevisiae AS2.114以及P. expansum AS3.3703测定CFS、hs-CFS、SC和hs-SC抗菌活性。

1.6添加CFS提高菌株AAA015抗菌活性的条件

1.6.1不同生长期菌株B. cereus AS1.1846 CFS对菌株AAA015抗菌活性的影响利用吸光度法测定菌株B. cereus AS1.1846在波长为600 nm处的生长曲线，分别取对数生长期、稳定期前期、稳定期后期和衰亡期的发酵液，利用“1.4”节的方法制备CFS。用接种环将斜面保存菌种AAA015接种至装有30 mL 2216E培养基的250 mL三角瓶中，30 ℃、160 r/min 培养36 h后作为种子培养基，按1%的接种量接种至装有50 mL Zhang等报道的发酵培养基[12]的250 mL三角瓶中，同时添加不同生长时期的CFS 2 mL，30 ℃、160 r/min培养3 d，8 000 r/min离心5 min，发酵液过 0.22 μm 滤膜后，采用牛津杯法，以S. aureus AS1.2465、E. coli AS1.487、S. cerevisiae AS2.114以及P. expansum AS3.3703为供试菌测定抗菌活性。以未添加CFS的单独培养菌株为对照。

1.6.2CFS添加量对菌株AAA015抗菌活性的影响其他条件按照“1.6.1”节方法不变，在接种Zhang等报道的发酵培养基[12]时分别向不同三角瓶内添加稳定期后期的CFS 05、1、2、3、4 mL，30 ℃、160 r/min 培养3 d，8 000 r/min离心 5 min，发酵液过 0.22 μm 滤膜后，采用牛津杯法测定抗菌活性。以未添加CFS的单独培养菌株为对照。

1.6.3CFS添加时间对菌株AAA015抗菌活性的影响利用吸光度法测定菌株AAA015在波长600 nm处的生长曲线。其他条件按照“1.6.1”节方法不变，分别在菌株AAA015培养初期、对数生长期、稳定期加入2 mL CFS，160 r/min培养 3 d 后采用牛津杯法测定抗菌活性。

2结果与分析

2.1平板共培养筛选具有抗菌活性的海葵共附生放线菌

以单独培养为对照，通过与B. cereus AS1.1846共培养，及利用S. aureus AS1.2465、E. coli AS1.487、S. cerevisiae AS2.114、P. expansum AS3.3703含菌平板进行共培养，筛选具有抗菌活性的海葵共附生放线菌。结果如表1和图2所示，利用平板共培养法和单独培养法对129株海葵共附生放线菌的抗菌活性进行筛选，共培养筛选法对S. aureus AS1.2465、E. coli AS1.487、S. cerevisiae AS2.114以及P. expansum AS3.3703的抗性菌株筛出率均显著显著高于单独培养法。选取其中抗菌活性最高的放线菌菌株（编号分别为AAA015、AAA016和AAA162）用于后续研究。endprint

2.2不同共培养菌株对3株放线菌产抗菌物质的影响

选革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、丝状真菌各2

种分别与3株具有抗菌活性的放线菌菌株共培养，以单培养的菌株为对照，置于不同供试菌平板上，30 ℃培养3 d后测定抑菌圈（表2）。总体看出，3种放线菌和8株菌株共培养后，部分共培养后显著提高了菌株的抗菌活性。有趣的是菌株AAA015与菌株B. cereus AS1.1846共培养后，产生了抗S. cerevisiae AS2.114的活性。

2.5添加CFS提高菌株AAA015抗菌活性的条件

2.5.1不同生长期菌株B. cereus AS1.1846 CFS对菌株AAA015抗菌活性的影响菌株B. cereus AS1.1846在牛肉膏蛋白胨培养基上的生长曲线见图3。制备培养16、20、34、40 h 后的CFS，分别添加到菌株AAA015发酵培养基中，发酵后利用牛津杯法测定发酵液抗菌活性（图4）。不同生长期的CFS对菌株AAA015抗菌活性的影响有显著差异。在B. cereus AS1.1846的对数生长中期及稳定初期，虽然CFS提高了菌株的抗菌活性，但是提高不显著，而稳定后期及衰亡期可显著提高菌株的抗菌活性。初步表明提高放线菌抗菌活性的物质产生于B. cereus AS1.1846的稳定期，可能属于次生代谢产物。

2.5.2CFS添加量对菌株AAA015抗菌活性的影响由图5可知，当CFS添加量超过1 mL后，其抗菌活性不再显著提高甚至略有下降趋势。表明提高菌株AAA015抗菌活性的物质具有浓度效应，达到一定阈值后，不再提高。

2.5.3CFS添加时间对菌株AAA015抗菌活性的影响利用吸光度法测定的菌株AAA015生长曲线见图6。根据生长曲线，分别在菌株AAA015培养0、12、24、32、40、52 h时加入1 mL CFS，160 r/min培養3 d后采用牛津杯法测定抗菌活性。

从发酵起始至衰亡期到来之前，添加CFS可以显著提高AAA015菌株的抗菌活性，但稳定期之前添加CFS的抗菌活性显著高于稳定后期添加的抗菌活性（图7）。

3讨论

自然界中的微生物是杂居混生的，微生物之间相互竞争生存资源和空间是刺激微生物产生抗菌物质的主要因素[13]。通过共培养提高天然产物产量或者刺激新颖天然产物产生的研究报道日益增多。Rateb等发现烟曲霉（Aspergillus fumigatus）同布利土放线菌（Streptomyces bullii）共培养后，可以产生7种单培养检测不到的化合物[8]。黄兵等研究了22株放线菌的单培养及它们与枯草芽孢杆菌的共培养发酵代谢

产物的差异，发现放线菌FXJ2.014、FXJ1.296、AS 4.1252等3株菌与枯草芽孢杆菌共培养时产生它们在相同条件下单培养时没有的物质，其中链霉菌FXJ2.014单培养时主要产生醌霉素A，共培养时产物中增加了生物活性与醌霉素A有显著差异的醌霉素结构类似物FXJ2.014-HB[14]。黄艳琴等研究发现，海绵细菌在抗菌活性方面具有正向和负向的协同效应[15]。郭鹏飞等通过薄层层析显色分析、生物自显影分析证明，共培养能诱导海绵相关微生物产生不同于单培养的代谢产物和抗菌活性物质[16]。共培养利用微生物的这种竞争提高抗菌物质产量或者产生新颖的抗菌物质，用于抗菌性菌株筛选后，可以提高抗菌性菌株，特别是新颖抗菌性菌株或新颖抗菌物质的筛选效率。

关于共培养提高菌株抗菌物质产量或者刺激产生新颖抗菌物质机制的报道较少。主要包括沉默基因簇的激活、群体感应（quorum sensing，简称QS）和基因水平转移（horizontal gene transfer，简称HGT）。大部分次级代谢产物合成基因簇在常规试验条件下处于沉默状态。若这些潜在的生物合成途径被激活，则有可能发现许多新活性产物[17-18]。Schroeckh等利用基因芯片技术结合透析试验和电镜成像技术证明了Aspergillus nidulans同Streptomyces rapamycinicus接触后激活了2个次级代谢产物基因簇的表达，产生新颖代谢产物[19]。群体感应是细菌生长到一定密度时相互感应，调控产生独特的、多样的群体行为现象。细菌共培养时的种间群体感应调控可以诱导目标微生物的次级代谢[20]。郭秀春等发现，外源病原菌S. aureus代谢产物中存在某种信号分子，能诱导NJ6-3-1在不产生抗菌物质的生长条件下代谢产生抗菌物质[21]。带化红球菌（Rhodococcus fascians）和稠李链霉菌（Streptomyces padanus）共培养，放线菌的基因水平转移诱导R. fascians产生新颖氨基糖苷类抗菌物质[22]。本研究中，菌株B. cereus AS1.1846所分泌的提高放线菌菌株AAA015抗菌活性的物质为次级代谢产物，具有浓度效应，推测和群体感应相关。接下来需要进一步对该物质进行纯化、结构鉴定及诱导效应研究，对推测予以证实。

4结论

本研究报道了1种基于平板共培养的抗菌性海洋放线菌筛选方法，和传统的单培养筛选方法相比，具有简单易行和明显提高抗菌性菌株筛选效率等优势。菌株B. cereus AS1.1846在稳定期分泌提高放线菌菌株AAA015抗菌活性的物质，在提高菌株AAA015抗菌活性中表现有浓度效应。在海洋放线菌AAA015发酵起始至衰亡期到来之前，添加含有该物质的CFS可以显著提高抗菌活性。

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