体外共培养软骨细胞与脂肪基质细胞用于软骨构建的实验研究

2014-09-12贾黎崔军

中国当代医药 2014年18期

贾黎++++崔军

[摘要] 目的探讨体外共培养软骨细胞与脂肪基质细胞（ADSCs）用于软骨构建的可行性。方法分别收集并培养人ADSCs与猪耳软骨细胞，设置实验组、阳性对照组、阴性对照组，分别接种ADSCs和软骨细胞（以7∶3比例混合）、单纯软骨细胞、单纯ADSCs，观察并对比三组的形态学变化、湿重、蛋白多糖含量、组织学特征及Ⅱ型胶原的表达情况。结果经过8周的体外培养，实验组组织形状规则，表现出软骨组织的结构特征，且有一定的弹性；对于平均湿重及蛋白多糖定量检测发现，实验组的平均湿重可达阳性对照组的73.1%、81.9%，与阴性对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）；HE染色显示实验组标本出现连续的软骨样组织，产生成熟的软骨陷窝及纤维性组织，新生软骨厚度较为明显，Ⅱ型胶原免疫组化染色发现，实验组软骨陷窝附近多处呈棕黄色，呈阳性反应。结论软骨细胞及ADSCs体外共培养可用于软骨组织的构建，还需进一步研究确定ADSCs转化为成熟软骨细胞的直接证据。

[关键词] 软骨细胞；脂肪基质细胞；共培养；软骨构建

[中图分类号] R321[文献标识码] A[文章编号] 1674-4721（2014）06（c）-0012-04

Experimental study of in vitro co-culture of chondrocytes and adipose-derived stromal cells for cartilage construction

JIA Li CUI Jun

Department of Stomatology,Peking University Shenzhen Hospital,Shenzhen 518000,China

[Abstract] Objective To investigate the feasibility of in vitro co-culture of chondrocytes and adipose-derived stromal cells (ADSCs) for cartilage construction. Methods ADSCs and porcine auricular chomdrocytes were collected and cultured in vitro,and then three groups were set as the experimental group,the positive control group and the negative control group,which were inoculated ADSCs and chondrocytes(7∶3 mixing ratio),simple chondrocytes,simply ADSCs respectively.And the contrast morphological changes,the wet weight,the proteoglycan content changes and type Ⅱ collagen in the expression of histological feature of the three groups was observed and analyzed respectively. Results After eight weeks in vitro culture,the tissue of experimental group had a regular shape,which looked like the structure of cartilage tissue and was certain flexibility.For detection ofthe average wet weight and proteoglycan quantitative,the average wet weight and proteoglycan could reach 73.1%,81.9% of that in the positive experimental group respectively,which were significantly higher than that in the negative control group(P<0.01).HE staining showed that the experimental group occurred consecutive cartilage-like tissue,mature cartilage and fibrous tissue,and new cartilage thickness was more obvious.Type Ⅱ collagen immunohistochemical staining found that brownish yellow occurred near lacunas of cartilage in the experimental group. Conclusion Chondrocytes and ADSCs co-culture in vitro can be used to build cartilage,but further research is need to determine the direct evidence of ADSCs converted to mature chondrocytes.

[Key words] Chondrocytes;Adipose-derived stromal cells;Co-culture;Cartilage construction

近年来，随着细胞生物学和生物材料研究的不断发展，组织工程学逐渐成为新兴的学科，其利用生物材料为载体将种子细胞置入体内，并产生有功能组织，为组织损伤的修复提供新的思路和方法[1]。软骨损伤是临床较为常见的病症，同时自我修复能力有限，往往导致关节疼痛、行走困难等不适，影响患者的生活质量。目前，骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）诱导分化为软骨细胞的研究较多，但由于BMSCs的来源有限，大大限制了临床应用[2-3]。脂肪基质细胞（adipose-derived stromal cells，ADSCs）是一类与BMSCs有相同表型特征和生物学特性且可多向分化的干细胞，因其分布范围广泛，体外增殖较快，逐渐成为新的骨组织工程种子细胞。多项研究显示，与BMSCs相比，ADSCs的成软骨分化能力较弱[4]，因此，如何诱导ADSCs的成软骨分化及保持其稳定表达软骨表型成为临床亟待解决的问题。一般对于诱导ADSCs的成软骨分化往往通过添加大量的生长因子等进行，但成本高，体内诱导效果差[5]。国外研究发现，采用软骨细胞与BMSCs共培养诱导成软骨分化，成功构建软骨组织[6]。本研究采用软骨细胞与ADSCs共培养方式进行成软骨分化诱导，观察其体外构建成熟软骨组织的能力，探究体外共培养软骨细胞与ADSCs构建软骨组织的可行性。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

DMEM培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素溶液由美国Hyclone公司生产；BGJb培养基、Ⅰ型胶原酶由美国Gibco公司生产；Ⅱ型胶原购自美国Invitrogen公司；聚羟基乙酸、聚乳酸购自美国Sigma公司；离心设备选用德国Eppendorf 5810R台式高速离心机；CO2恒温培养箱购自美国Thermo Fisher公司。

1.2 ADSCs的分离和培养

脂肪来源于行吸脂手术的健康成人16例，年龄27~38岁，平均（32.7±6.2）岁；抽脂部位包括腰部、腹部及大腿部；所有行抽脂术者均无传染病及内分泌系统疾病。取获取的皮下脂肪50 ml置于超净工作台，采用含有1000 U/L青霉素和链霉素的PBS反复冲洗，以除去血细胞及麻醉药物，0.075%的Ⅰ型胶原酶处理，37℃振荡消化60 min，300×g离心10 min收集下层沉淀细胞，并除去悬浮的脂肪细胞及脂滴，取BGJb培养基重悬细胞，并以3500/ml浓度接种于25 cm2培养瓶，37℃、5%CO2、饱和湿度下培养，间日换液，至细胞生长至培养瓶的80%～90%时进行传代。

1.3 软骨细胞的分离和培养

软骨细胞取自猪耳廓部位，具体操作如下：无菌切取部分猪耳廓，除去皮肤及软骨膜，采用眼科剪将其剪成3 mm×3 mm的片状；加入0.2%Ⅱ型胶原酶消化处理过夜，至有单个细胞游离后，加入DMEM培养液终止消化；采用移液器轻轻吹打，分离细胞团，采用200目滤网过滤，收集滤液；1500 r/min离心5 min，收集沉淀，采用含10%胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞，并以2.0×104/cm2的密度接种，37℃、5%CO2、饱和湿度下培养，间日换液，至细胞生长近汇合后，消化并收集细胞备用[7]。

1.4 PGA/PLA复合生物材料的制备[8]

称取聚羟基乙酸（PGA）15 mg嵌入圆柱状硅胶模具（直径8 mm，高2 mm），采用二氯甲烷制备0.1%的聚乳酸（PLA）溶液，取0.5 ml滴加至嵌入PGA的硅胶模具内，待其自然晾干，置于75%乙醇内浸泡消毒30 min，后采用PBS反复冲洗，以确保除净酒精，吸干备用。

1.5 实验分组与体外培养

本实验共设置3组，分别为实验组、阳性对照组、阴性对照组，每组设置6例标本，其中实验组采用软骨细胞与ADSCs共培养，两者按照3∶7的比例混合，接种200 μl浓度为5.0×107/ml的混合细胞悬液于预制的PGA/PLA支架上；阳性对照组及阴性对照组按照相同的接种量分别接种单纯软骨细胞及单纯ADSCs。将接种好的PGA/PLA支架于37℃、5%CO2、饱和湿度下体外培养8周，取材检测。

1.6 体外诱导培养的检测

1.6.1 形态学观察观察内容包括各组细胞-材料复合物经体外培养后的大小、形状、色泽等，并对比分析各组间的差异。

1.6.2 湿重及蛋白多糖定量检测分别测定各组标本的湿重及蛋白多糖含量，其中蛋白多糖的定量测定采用阿利辛蓝法[9]进行，对比分析各组间的差异。

1.6.3 HE染色检测将培养8周后的组织采用10%福尔马林溶液固定，制作石蜡切片，行HE染色，观察细胞-材料复合物的组织结构，如组织连续性、软骨陷窝形成及生物材料的降解情况等。

1.6.4 Ⅱ型胶原表达的免疫组化检测同上，制作石蜡切片，实验操作按照石蜡切片的免疫组化方法进行，包括烘片、脱蜡、复水、漂洗、封闭等步骤，加入抗Ⅱ型胶原单克隆抗体（鼠抗人，英国Abcam公司），4℃孵育过夜，后采用PBS漂洗3次，加入生物素化的二抗（羊抗鼠，英国Abcam公司）孵育，后进行DAB显色及HE染色，并封片镜检，于荧光显微镜下观察Ⅱ型胶原表达情况。

1.7 统计学处理

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据处理，计量资料以x±s表示，采用F检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 形态学观察结果

经过8周的体外培养，实验组及阳性对照组的组织形状规则，表现出软骨组织的结构特征，有一定的弹性，其直径及厚度较PGA/PLA支架无显著变化，而阴性对照组未表现出软骨组织特征，细胞-材料复合物结构松散，出现皱缩变形。

2.2 3组湿重及蛋白多糖含量的比较

实验组及阳性对照组的平均湿重大于阴性对照组，平均蛋白多糖含量高于阴性对照组，差异有统计学意义（P<0.01）（表1）。

表1 3组湿重及蛋白多糖含量的比较（x±s）

与阴性对照组比较，*P<0.01

2.3 各组HE染色及免疫组化结果

HE染色结果显示，实验组出现连续的软骨样组织，成熟的软骨陷窝及纤维性组织产生，仍残留少量PGA纤维，标本内部出现一定程度的松散，但新生软骨厚度较明显；阳性对照组多为均一的成熟软骨组织，仅在中心位置处出现结构松散；阴性对照组标本未出现成熟软骨陷窝，以纤维性组织为主。通过免疫组化染色观察Ⅱ型胶原的表达情况发现，实验组及阳性对照组的软骨陷窝处呈阳性反应，出现棕黄色，表明软骨细胞与ADSCs共培养成功诱导ADSCs向软骨细胞分化，而单纯接种ADSCs的阴性对照组未呈现阳性反应，无Ⅱ型胶原表达（图1）。

图1 各组HE染色及免疫组化结果

a、d.实验组，b、e.阳性对照组，c、f.阴性对照组；a～c为HE染色结果，d～f为免疫组化结果

3 讨论

目前，ADSCs的多向分化潜能被广泛认识，由于其来源广泛，便于取材，且增殖活性高，逐渐代替BMSCs成为骨组织工程的种子细胞。在对软骨组织损伤修复的实验中，多项研究显示ADSCs诱导向软骨细胞分化的活性较BMSCs低，同时对于诱导条件（如生长因子、血清、氧分压等）要求较高，单纯采用ADSCs构建软骨组织并不能取得理想的效果[10]。近年来，有研究采用软骨细胞与BMSCs共培养，可以有效地诱导BMSCs向软骨细胞分化，表明软骨细胞的存在能够为BMSCs的定向诱导提供适宜的微环境[11]。鉴于ADSCs与BMSCs的结构和功能的相似性，本研究通过体外共培养软骨细胞与ADSCs，观察其软骨组织定向诱导的效果，结果发现，经过8周的体外培养，实验组组织形状规则，表现出软骨组织的结构特征，且有一定的弹性；对于平均湿重及蛋白多糖定量检测发现，实验组的平均湿重可达阳性对照组的73.1%、81.9%，同时与阴性对照组相比差异有统计学意义；HE染色显示实验组标本出现连续的软骨样组织，产生成熟的软骨陷窝及纤维性组织，新生软骨厚度较为明显，Ⅱ型胶原免疫组化染色发现，实验组软骨陷窝附近多处呈棕黄色，呈阳性反应，表明软骨细胞与ADSCs共培养能够成功诱导ADSCs向软骨细胞分化。

对于软骨细胞如何诱导ADSCs定向分化的机制，可能原因如下：①软骨细胞的存在，能够分泌多种生长因子[12-13]，包括TGF-β、IGF1等，从而促进ADSCs的定向分化；②软骨细胞表面表达的整合素及细胞外基质如Ⅱ型胶原等，构成软骨微环境，激活相关细胞信号通路，从而在ADSCs的定向分化中发挥作用[14]。目前具体机制尚不明确，还需进一步深入研究。本研究采用PGA/PLA支架进行体外培养，主要是为了增加软骨细胞与ADSCs间的接触从而更好地发挥其诱导作用，同时便于软骨组织均匀生长。对于软骨细胞与ADSCs的比例选取，借鉴有关BMSCs与软骨细胞体外共培养的报道[15-16]，同时考虑ADSCs定向诱导成软骨分化的能力，选取以软骨细胞∶ADSCs=3∶7的比例混合，但其是否是最佳的诱导比例还需后续实验进一步探索。

综上所述，软骨细胞及ADSCs体外共培养可用于软骨组织的构建，但因共培养体系中含有30%的软骨细胞，尚不足以明确证实ADSCs的确转化为成熟的软骨细胞，后续实验中可采用荧光标记的ADSCs进行诱导，通过示踪其诱导分化过程，从而为ADSCs与软骨细胞共培养成功诱导ADSCs定向分化为软骨细胞提供直接证据。

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（收稿日期：2014-03-09本文编辑：李亚聪）