LINC00997 在胃贲门腺癌中表达的临床意义及其对SGC7901 细胞迁移、侵袭和EMT的影响

梁佳，沈素朋，郭炜，郭艳丽，董稚明（河北医科大学第四医院 肿瘤研究所，河北 石家庄 050011）

胃贲门腺癌（gastric cardia adenocarcinoma，GCA）是胃癌中侵袭性最强的一种类型，相对于其他类型的胃癌，其发病率及病死率均较高[1-2]。由于GCA 出现症状时，大多数患者已到疾病的中、晚期，加上术后复发率较高，导致患者预后不良。lncRNA 是指长度大于200 nt、无蛋白质编码能力的RNA 分子[3-4]。越来越多的研究结果[5-7]表明，lncRNA 的异常表达参与多种类型恶性肿瘤的发生和进展。LINC00997 在肾透明细胞癌、宫颈癌及结直肠癌中均异常表达[8-10]，但其在GCA中的作用研究鲜见文献报道。本研究通过检测LINC00997在人GCA组织及胃癌细胞中的表达水平，分析其表达与患者临床病理特征及预后的关系，同时应用siRNA 干扰胃癌细胞SGC7901 中LINC00997 的表达，观察敲减LINC00997 对胃癌SGC7901 细胞迁移、侵袭以及上皮间质转化（EMT）进程的影响，并探讨其在GCA 发生与发展中的作用及其机制，为GCA 的靶向治疗及预后评估提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 LINC00997表达数据的来源及分析

利用在线数据分析网站GEPIA2（http://gepia2.cancer-pku.cn/）分析TCGA和GTEx数据库中LINC00997在胃癌组织中的表达数据，其中胃癌组织408例，癌旁组织211例。根据LINC00997表达水平进行胃癌患者总生存期（OS）和无病生存率（DFS）的分析，其中LINC00997高表达组190例，低表达组192例，采用对数秩检验，用于假设检验。

1.2 临床标本、细胞及主要试剂

临床标本取自2013年2月至2015年12月河北医科大学第四医院生物标本库的68例GCA手术患者，其中男性37 例、女性31 例，年龄39～74岁，中位年龄60.0岁。全部患者术前均未接受任何放射与化学治疗。每例患者均取GCA原发灶组织及距原发灶边缘3～5 cm的相应癌旁组织。所有标本的切取和使用均经过本院医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。手术切除标本一部分常规制作蜡块、H-E染色，另一部分置入-80℃低温冰箱中保存，用来提取总RNA。所有组织标本均由3位病理医师共同确诊为GCA组织，癌旁组织中均未见癌细胞浸润。对68例GCA患者进行随访，最长时间为65个月，中位随访时间为49个月。

人胃癌细胞SGC7901、HGC-27、BGC823 和MGC-803由河北医科大学第四医院肿瘤研究所病理研究室留存并传代。TRIzol 试剂盒购自北京索莱宝公司，逆转录试剂盒和MTS试剂均购自美国Promega公司，胎牛血清购自美国PAN 公司，RPMI 1640 培养基购自美国Gibco公司，Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Thermo 公司，Transwell 小室和人工基膜（matrigel 胶）购自美国Corning 公司。蛋白提取试剂购自北京康为世纪生物科技有限公司），兔抗人上皮钙黏素（E-cadherin）、神经钙黏素（N-cadherin）、波形蛋白（vimentin），以及β-actin等一抗均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，HRP 标记的羊抗兔IgG二抗购自美国KPL公司，电化学发光试剂购自北京索莱宝生物科技有限公司。

1.3 qPCR法检测GCA组织及胃癌细胞中LINC00997及EMT相关基因的表达

根据TRIzol 试剂说明提取组织和细胞的总RNA，并将总RNA 逆转录成cDNA，再以cDNA 为模板进行PCR 扩增，用于检测LINC00997 及EMT 相关基因的表达，以GAPDH 作为内参，引物序列见表1。PCR 反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共40个循环；72 ℃延伸7 min，每个样本设3 个复孔。根据每孔荧光信号达到阈值时经历的循环数作为CT值，采用相对定量法，ΔCT=CT目的基因-CT内参基因，ΔΔCT=ΔCT-ΔCT对照组，以2-ΔΔCT表示目的基因mRNA的相对表达量。

表1 qPCR引物序列

1.4 特异性siRNA的构建、细胞培养及转染

2 条siRNA-LINC00997 由上海吉玛基因公司设计合成，分别命名为si-LINC00997#1、si-LINC00997#2，si-NC作为对照。常规培养细胞，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。转染前一天选择生长状态良好的细胞均匀铺于6孔板中，待细胞汇合度至70%左右开始转染，按照Lipofectamine 2000 转染试剂盒说明分别将si-LINC00997#1、si-LINC00997#2 及其si-NC 转染至SGC7901细胞，6 h后更换含血清培养基继续培养24 h，提取各组细胞的总RNA，用于观察转染后细胞中LINC00997 的表达水平，选取干扰效率较高的细胞进行后续功能实验。

1.5 划痕愈合实验检测干扰LINC00997表达对SGC7901细胞迁移的影响

实验开始前用直尺比对，用记号笔在6孔板背面均匀划横线。转染细胞培养24 h后，调整细胞密度（5×105个/mL）接种于6孔板，待细胞长至完全融合时，用200 μL加样枪头比着直尺，垂直于横线划痕。使用PBS冲洗2次，分别于划痕后的0、24 h在倒置显微镜下（×100）观察细胞的迁移距离，计算细胞的划痕愈合率。

1.6 Transwell侵袭实验检测干扰LINC00997表达对SGC7901细胞侵袭的影响

将50 μL稀释好的matrigel胶预铺于Transwell小室上层内，37 ℃过夜。使用无血清培养基饥饿SGC7901 细胞24 h，胰酶消化并收集各组细胞，无血清培养基重悬细胞并调整细胞密度为1×105个/mL，每孔上室加入200 μL 细胞悬液，下室中加入600 μL含20%胎牛血清的完全培养基。培养24 h后取出小室，PBS 洗3 次，结晶紫染色、固定后，用棉签轻轻擦除上室中matrigel 胶及胶上细胞，PBS 冲洗后室温晾干，于倒置显微镜下计数5 个随机视野内的细胞数，比较各组穿膜细胞数。

1.7 WB法检测干扰LINC00997表达对SGC7901细胞中EMT相关蛋白表达的影响

按照蛋白提取试剂盒说明提细胞总蛋白，按照BCA 蛋白浓度测定试剂盒说明书测定蛋白浓度，取适量蛋白样品进行10% SDS-PAGE，将蛋白质转移至PVDF 膜上，入5%脱脂奶粉的封闭液中室温处理1 h，加入一抗E-cadherin（1∶2 000）、N-cadherin（1∶6 000）、vimentin（1∶2 000）及β-actin（1∶10 000），在摇床上4 ℃过夜。TBST清洗膜3次（5 min/次），加入HRP 标记的羊抗兔IgG（1∶100 000），室温下静置1 h 后，用TBST 清洗膜3 次（5 min/次），用电化学发光法曝光、显影。以β-actin为内参照，用ImageJ软件分析蛋白条带的灰度值。

1.8 统计学处理

qPCR 法、WB 法、划痕愈合实验、Transwell 侵袭实验等均重复3次。采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，符合正态分布的计量数据以表示，两组间比较采用独立样本t检验和近似t检验，多组间的均数比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用SNK-q检验；应用Kaplan-Meier 生存曲线分析LINC00997 表达与GCA 患者预后的关系，采用Log-Rank 检验比较两组OS 和DFS 差异，Cox 多因素回归分析影响GCA 患者预后的独立危险因素。以P＜0.05或P＜0.01表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LINC00997在胃癌组织中高表达且与患者预后不良相关

利用GEPIA2 网站分析TCGA 和GTEx 数据库中LINC00997在胃癌中的表达及其对胃癌患者OS的影响，结果发现，LINC00997 在胃癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织（P＜0.05，图1A），LINC00997高表达组患者的OS（图1B）及DFS（图1C）均显著低于LINC00997低表达组患者（P＜0.05或P＜0.01）。

2.2 LINC00997在GCA组织及胃癌细胞中高表达

qPCR法检测结果显示，LINC00997在GCA组织中表达水平显著高于癌旁组织（P＜0.01，图2A）。结合临床病理资料分析发现（表2），GCA 组织中LINC00997 表达与患者的淋巴结转移（P＜0.05）及TNM 分期相关联（P＜0.01）。同时发现，LINC00997在胃癌SGC7901、HGC-27、BGC823 和MGC-803细胞中的表达水平均显著高于对照组（P＜0.05 或P＜0.01；图2B）。

表2 LINC00997在GCA组织中的表达与患者临床病理特征的关系

2.3 LINC00997表达与GCA患者预后的关系

根据LINC00997在GCA组织中表达的均值将患者分为LINC00997 高表达组（36 例）和低表达组（32 例）。经Log-Rank 检验分析显示，LINC00997 高表达可明显缩短GCA 患者的5年OS（P＜0.01，图3）；Cox 多因素回归分析发现，LINC00997 表达是GCA患者独立的预后因素（P＜0.01，表3）。

表3 影响GCA患者预后的临床病理特征的单因素和多因素分析

2.4 转染si-LINC00997 可显著抑制胃癌SGC7901细胞的迁移及侵袭能力

qPCR法检测结果（图4A）显示，si-LINC00997#1和si-LINC00997#2组SGC7901细胞中LINC00997表达水平显著降低（P＜0.05或P＜0.01），表明转染成功。由于si-LINC00997#1 组的干扰效率最高（P＜0.01），所以，选择si-LINC00997#1 组细胞进行后续功能实验。

划痕愈合实验结果（图4B）显示，转染24 h 时，si-LINC00997#1 组SGC7901 细胞的划痕愈合率显著低于si-NC 对照组（P＜0.01）。Transwell 侵袭实验结果（图4C）显示，si-LINC00997#1 组穿膜细胞数显著少于si-NC 组（P＜0.01）。实 验 结果表明，敲减LINC00997可显著抑制胃癌SGC7901细胞的迁移和侵袭能力。

2.5 敲减LINC00997 可显著抑制胃癌SGC7901 细胞的EMT进程

qPCR法检测结果（图5A）显示，敲减LINC00997后，SGC7901细胞中E-cadherin 的表达水平显著上调（P＜0.05），但N-cadherin 和vimentin 表达均显著下调（P＜0.05或P＜0.01）。

WB 法检测结果（图5B）显示，与si-NC 组比较，敲减LINC00997后，SGC7901细胞中E-cadherin表达显著上调（P＜0.05），N-cadherin 和vimentin 表达均显著下调（均P＜0.01）。结果表明，敲减LINC00997 可显著抑制胃癌SGC7901细胞的EMT进程。

3 讨论

LINC00997 是一种新发现的lncRNA，位于染色体7p14.3，此位置在很多恶性肿瘤中有基因拷贝数的异常扩增[11-12]。为了探索LINC00997 在恶性肿瘤中的表达，利用GEPIA2 网站分析了TCGA 和GTEx 数据库数据，结果发现LINC00997 在多种肿瘤中高表达，包括胃癌、肾乳头状细胞癌、前列腺癌、胆管癌、食管癌、头颈部鳞状细胞癌、皮肤黑色素瘤和肝细胞癌等，提示LINC00997可能发挥癌基因的作用。

LINC00997 在肾透明细胞癌[8]、结肠癌[9]及宫颈癌[10]中均异常表达。本研究通过分析TCGA和GTEx数据库中的相关数据发现，LINC00997在胃癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织，且其高表达组胃癌患者的OS 及DFS 均显著低于低表达组患者（均P＜0.05）。在随后的验证中，本研究检测了68例GCA组织和相应癌旁组织中LINC00997 的表达水平，结果发现LINC00997 在GCA 组织中高表达，而且其表达水平与淋巴结转移及TNM分期相关联；同时，分析了LINC00997 表达与GCA 患者预后之间的关系，结果显示，LINC00997 高表达明显缩短了GCA 患者的OS；Cox 多因素回归分析发现，LINC00997 表达是GCA患者独立的预后因素。

CHANG等[8]研究发现，LINC00997通过与STAT3 结合上调S100A11 表达，提高转移相关分子vimentin、MMP2 和MMP7 的水平，进而促进肾透明细胞癌的转移。SHI 等[9]的研究结果显示，在转移性结直肠癌组织中LINC00997 表达水平升高，沉默LINC00997后显著抑制了结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭，其机制为LINC00997 通过靶向miR-512-3p调控结直肠癌细胞的转移。CHU 等[10]研究发现，LINC00997 在宫颈癌组织中高表达，通过调控miR-574-3p/CUL2轴激活MAPK信号转导，从而促进宫颈癌细胞的增迁移和侵袭。以上研究结果提示，LINC00997可能与恶性肿瘤的高侵袭和转移力相关。因此，本课题组设计了细胞迁移和侵袭体外实验，进一步探究LINC00997 对胃癌SGC-7901 细胞的迁移和侵袭的影响，结果显示，敲减LINC00997后显著抑制胃癌SGC-7901 细胞的迁移及侵袭能力，提示LINC00997 在胃癌细胞转移与侵袭中可能发挥重要作用，与既往研究结果[8-10]一致。

转移是造成恶性肿瘤预后不良的主要原因，寻找与转移相关的分子标志物对于延长患者OS 具有重要意义[13-14]。EMT是与恶性肿瘤侵袭、转移相关的最重要的通路[15-16]。为了研究LINC00997 是否参与胃癌的EMT进程，本研究检测了EMT相关标志物的表达变化，敲减LINC00997后，SGC-7901细胞中上皮相关标志物E-cadherin的表达升高，间充质相关标志物N-cadherin、vimentin的表达降低，提示LINC00997有可能参与EMT 进程并通过调控EMT 相关基因的表达，进而促进胃癌细胞的迁移及侵袭能力，但其具体的分子机制尚未明了。大量研究结果[17-21]表明，lncRNA通过ceRNA机制参与肿瘤的发生，猜测其也很有可能通过miRNA 分子海绵机制发挥调控作用，这有待在今后的研究中得到证实。

综上所述，本研究结果显示LINC00997 在GCA组织中高表达并导致预后不良，特异性的敲减LINC00997 的表达可显著抑制胃癌细胞的迁移及侵袭能力，并抑制EMT 进程，提示LINC00997 可能在GCA 中是一种促癌基因，并在肿瘤转移中发挥重要作用，有望成为GCA预后评估的标志物。