靶向融合肽IL-4Rα-lytic对原发性渗出性淋巴瘤的抑制作用

郑响，陈小亭，蔡启良，魏芳（.上海交通大学 生命科学技术学院 盛毓绶细胞与免疫学研究中心，上海 0040；.复旦大学基础医学院 教育部/卫生部医学分子病毒学重点实验室，上海 0003）

原发性渗出性淋巴瘤（primary effusion lymphoma，PEL）是一种罕见的霍奇金淋巴瘤，主要表现为腹水、胸腔积液和心包积液等[1-2]。PEL的恶性程度高，常规化疗药物治疗效果不佳，预后极差，患者中位生存期少于6 个月[3-4]，因此亟待研发安全有效的治疗手段。PEL 通常与卡波西肉瘤相关疱疹病毒（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus，KSHV）感染相关[5-9]。本课题组前期的研究结果[10-11]显示，处于KSHV 感染潜伏期的PEL 细胞均不同程度地过表达IL-4Rα，而KSHV 阴性细胞则不表达或低表达IL-4Rα；过表达IL-4Rα引起JAK1-PI3K-Akt信号通路的组成型激活，从而促进潜伏期肿瘤的生长。研究结果[12-13]发现，IL-4R高表达与多种类型恶性肿瘤相关，并在以其为治疗靶点的研究中观察到药物对肿瘤长期、持续的疗效。上述研究结果均提示，IL-4Rα可能是KSHV阳性PEL的潜在治疗靶点。利用带负电的膜磷脂酰丝氨酸在多数肿瘤与正常细胞细胞膜上表达水平的差异，PAPO等[14]合成非对映体裂解肽（包含D-和L-形式的亮氨酸和赖氨酸等15个氨基酸），并发现此裂解肽能够因癌细胞表面酸性成分的静电吸引而具有一定的细胞选择性，随后通过类似阳离子抗菌肽的工作原理裂解细胞膜。KOHNO等[15]在此基础上，通过优化氨基酸序列设计了裂解肽Lytic，减少了对正常细胞的杀伤。之后，YANG 等[16]设计的靶向融合肽IL-4Rα-lytic 含有靶向IL-4Rα 的靶向肽和裂解肽Lytic 两个片段，可特异地靶向多种类型表达IL-4Rα 受体的肿瘤细胞（如胰腺癌、乳腺癌等细胞）。本研究旨在检测靶向融合肽IL-4Rα-lytic对KSHV阳性PEL细胞的体内外杀伤效果，并分析其安全性，为PEL的治疗提供新的思路和理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂及仪器

人B细胞淋巴瘤细胞系BCBL-1、BCP-1和BJAB由本室保存，荧光素酶标记的BCBL-1细胞为本实验室前期构建[17]。所有细胞均采用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基，于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。6周龄、体质量20 g左右的雌性NOD/SCID小鼠购自维通达生物技术有限公司（实验动物合格证号：20210402Abzz0619000685）。CCK-8 试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，AnnexinⅤ-APC/PI试剂盒购自BD Biosciences 公司。IVIS Spectrum 活体光学成像系统购自美国珀金埃尔默公司，荧光素底物购自翌圣生物科技股份有限公司，正倒置一体荧光显微镜购自美国ECHO 公司，pocH-100i 全自动血液分析仪购自日本希森美康公司。组织切片和H-E 染色由武汉赛维尔生物科技有限公司完成。

1.2 多肽合成

IL-4Rα-lytic 和Lytic 由上海强耀生物科技有限公司合成。多肽均用固态合成法合成（纯度＞95%），并经过质谱分析验证。多肽溶解在PBS（pH=7.4）中。IL-4Rα-lytic:KQLIRFLKRLDRNGGGKLLLKLL KKLLKLLKKK（有下划线的氨基酸为D型氨基酸）；Lytic:KLLLKLLKKLLKLLKKK（有下划线的氨基酸为D型氨基酸）。

1.3 MTT 法检测IL-4Rα-lytic 对KSHV 阳性PEL 细胞的杀伤效果

将密度为5×105个/mL 的KSHV 相关细胞（包括KSHV阳性PEL细胞BCBL-1、BCP-1和KSHV 阴性细胞BJAB）悬液接种于96孔板（50µL/孔），然后加入2.5、5、10或20µmol/L的IL-4Rα-lytic或Lytic溶液（50µL/孔），于37 ℃、5%CO2条件下培养2 h后，每孔加入CCK-8试剂10µL，通过酶标仪检测450 nm波长处各孔细胞的光密度（D）值，并计算细胞存活率（细胞存活率=实验组D450/对照组D450×100%）。实验重复3次。

1.4 FCM检测IL-4Rα-lytic和Lytic对KSHV 阳性PEL细胞凋亡的影响

将密度为1×106个/mL 的BCBL-1、BCP-1 和BJAB 细胞置于12 孔板中，分别加入IL-4Rα-lytic 和Lytic 溶液（终浓度均为5 µmol/L），同时对照组加入等体积培养基，37 ℃下处理2 h。离心、冷染色缓冲液洗涤后，用100 µL 结合缓冲液重悬细胞。每管依次加入0.5 µL Annexin Ⅴ-APC 和1µL PI，室温下避光15 min，加400µL 结合缓冲液，混匀，上机检测细胞的凋亡情况。实验重复3次。

1.5 BCBL-1细胞小鼠移植瘤模型的建立及观察

将荧光素酶标记的BCBL-1 细胞经腹腔注射至NOD/SCID小鼠体内（注射剂量为1×107个细胞/只），建立小鼠异种移植模型。细胞植入后第9天，小鼠腹腔注射荧光素底物（150 mg/kg），利用活体生物发光成像技术检测小鼠体内肿瘤的生长情况。随后，将具有相似信号强度的荷瘤小鼠随机分成PBS 组（对照组）和IL-4Rα-lytic 组（4 只/组），经腹腔分别注射PBS 和IL-4Rα-lytic（5 mg/kg），每周3 次，连续3 周。在药物治疗过程中，每2～3 d 称量一次小鼠体质量。3 周后，再次进行活体光学成像检测移植瘤的大小，然后经尾静脉取血，用全自动血液分析仪进行血液分析。第23 天时处死小鼠，切取肺、肝和肾组织标本，经固定、石蜡包埋、H-E 染色后，在正倒置一体荧光显微镜下观察并拍照。

1.6 统计学处理

采用GraphPad Prism 6 软件对实验数据进行统计分析，符合正态分布的计量数据以表示，组间差异比较采用t检验，以P＜0.05或P＜0.01表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IL-4Rα-lytic选择性杀伤KSHV阳性PEL细胞

经IL-4Rα-lytic 处理2 h 后，MTT法检测结果（图1A）显示，与Lytic 组比较，IL-4Rα-lytic 组KSHV 阳性细胞BCBL-1、BCP-1 和KSHV 阴性细胞BJAB 存活率均呈现剂量依赖性梯度降低（均P＜0.01）。其中，5µmol/L 的IL-4Rα-lytic 可以杀伤60%以上的BCBL-1、BCP-1细胞，而对BJAB细胞的杀伤力较弱。IL-4Rα-lytic杀伤BCBL-1、BCP-1和BJAB细胞的IC50分别为2.37、2.81和7.97µmol/L，而Lytic杀伤BCBL-1、BCP-1 细胞的IC50分别为26.05和21.67 µmol/L。Lytic杀伤BCBL-1、BCP-1 细胞的IC50分别是IL-4Rα-lytic的11.0 和7.7 倍。在观察浓度中未检测到Lytic 处理对BJAB细胞的明显杀伤作用。

随后，检测了IL-4Rα-lytic 不同处理时间的杀伤效果，结果（图1B）显示，5 µmol/L 的IL-4Rα-lytic 可在10 min 内诱导60%以上的KSHV 阳性PEL 细胞BCBL-1 和BCP-1 死亡（均P＜0.01），而5 µmol/L 的Lytic处理相同时间未造成明显的细胞死亡。这一杀伤水平未随着时间增加而增强，提示IL-4Rα-lytic 对KSHV 阳性PEL 细胞的杀伤主要是通过IL-4Rα-lytic穿膜而导致的快速杀伤。

2.2 IL-4Rα-lytic可诱导KSHV阳性PEL细胞凋亡

用5µmol/L 的IL-4Rα-lytic 处理2 h 后，FCM检测结果（图2）显示，与对照组和Lytic组比较，IL-4Rα-lytic组KSHV 阳性BCBL-1 和BCP-1 细胞凋亡率均显著升高（均P＜0.05），而KSHV阴性BJAB细胞凋亡率未见明显变化。说明，IL-4Rα-lytic 可在体外选择性诱导KSHV阳性PEL细胞凋亡而杀伤肿瘤细胞。

2.3 IL-4Rα-lytic显著抑制BCBL-1细胞小鼠移植瘤的生长

鉴于IL-4Rα-lytic 体外对BCBL-1 细胞的强杀伤活性，进一步观察了IL-4Rα-lytic 对BCBL-1 细胞小鼠移植瘤生长的作用及其安全性。结果如图3所示，治疗前IL-4Rα-lytic组与PBS组的平均荧光强度无显著性差异（P＞0.05），治疗3周后PBS组移植瘤生长迅速，而在IL-4Rα-lytic 组BCBL-1 细胞移植瘤的生长速率明显减缓（P＜0.05），甚至有1只小鼠观察到肿瘤负荷降低。

肺、肝、肾组织切片的H-E 染色结果（图4A）显示，IL-4Rα-lytic 组未见明显转移灶，同时组织细胞形态正常，表明IL-4Rα-lytic 对于肺、肝、肾无明显器官毒性。IL-4Rα-lytic 组与PBS 组小鼠体质量比较差异无统计学意义（P＞0.05，图4B）。此外，全血常规检测结果（表1）显示，IL-4Rα-lytic组小鼠的白细胞总数（WBC）、红细胞总数（RBC）、血红蛋白浓度（HGB）、红细胞平均血红蛋白量（MCH）、红细胞平均体积（MCV）、小型白细胞占白细胞总数百分比（W-SCR）、中型白细胞占白细胞总数百分比（W-MCR）、大型白细胞占白细胞总数百分比（W-LCR）等指标与PBS组小鼠比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

表1 IL-4Rα-lytic对NOD/SCID小鼠血液指标的影响（n=4）

实验结果表明，IL-4Rα-lytic可显著抑制BCBL-1细胞小鼠移植瘤的生长，且无明显的毒副作用。

3 讨论

PEL恶性程度高、预后较差、长期生存者少，目前主要采用CHOP 方案化疗和逆转录病毒治疗法联用进行治疗。但是，常规治疗所用药物在杀伤肿瘤细胞的同时也会对正常细胞产生杀伤，同时肿瘤细胞的耐药性也影响着治疗效果。此外，PEL 不常见，临床研究多局限于个案报道，可用的特效药物少，因此研发新型的毒副作用小的靶向治疗药物并探究其作用机制对于治疗PEL意义重大。

小分子短肽因其具有良好的肿瘤穿透能力、无耐药性问题、易于合成修饰和低免疫原性[17-21]等优点，逐渐成为肿瘤治疗的热点。本研究所使用的细胞裂解肽Lytic是由17个氨基酸组成的短肽，带正电荷，而肿瘤细胞表面负电性的磷脂酰丝氨酸水平略高于正常细胞，因此该裂解肽Lytic 对于肿瘤细胞的杀伤略强于正常细胞。同时，由于裂解肽含有D型氨基酸，能有效防止其被蛋白水解酶水解，从而延长作用时间[21]。将能靶向IL-4Rα 的靶向肽与Lytic 结合，可选择性杀伤PEL 细胞，同时减少对正常细胞的杀伤。靶向融合肽IL-4Rα-lytic 杀伤BJAB 细胞的IC50分别是杀伤BCBL-1、BCP-1细胞的3.4和2.8倍，同时裂解肽Lytic 杀伤BCBL-1、BCP-1 细胞的IC50分别是IL-4Rα-lytic 的11.0 和7.7 倍。这说明，相比较于KSHV 阴性细胞，IL-4Rα-lytic 对KSHV 潜伏感染的PEL细胞有选择性杀伤作用。为分析其杀伤机制，本研究进行了短时间的杀伤活性以及促凋亡能力的测定，快速的杀伤及促凋亡提示靶向融合肽IL-4Rα-lytic通过穿膜和诱导凋亡两种方式来达到杀伤PEL细胞的目的。小鼠移植瘤实验结果表明，IL-4Rα-lytic 经由腹腔注射能显著抑制BCBL-1细胞移植瘤的生长，同时对于肺、肝、肾等器官均无明显毒副作用，各项血液检测指标正常，提示IL-4Rα-lytic的安全性较高。

总之，本研究提供了一种针对PEL的特异性强、安全性高的靶向融合肽IL-4Rα-lytic，为进一步的动物实验和PEL的治疗提供了新的思路和实验基础。