RUNX家族在寻常型银屑病皮损中的表达

洪丹， 梁丽住， 郭书萌， 王亮春， 石臻睿

中山大学孙逸仙纪念医院，广东 广州 510120

银屑病是一种常见的慢性炎症性皮肤病，表皮的异常增殖分化、真皮炎症细胞的浸润和真皮乳头毛细血管的增生、扩张是银屑病的三大病理基础特征[1]。辅助性T细胞(T helper cell，Th)17和相关细胞因子在银屑病的发生、发展中扮演重要角色，Th17相关细胞因子如白细胞介素(interleukin，IL)-17A、IL-17F等能够刺激角质形成细胞增殖、分化，诱导炎症细胞如中性粒细胞的迁移和活化，促进毛细血管的增生，直接影响银屑病的上述病理改变[2]。临床上针对IL-17A及其相关通路的生物制剂能够使疾病缓解率达80%以上，也印证IL-17A通路在银屑病发病中的关键作用[3]。

Runt相关转录因子(runt-related transcription factor，RUNX)主要包括RUNX1、RUNX2和RUNX3三个成员。作为细胞信号传导的一类重要转录因子，在细胞发育、增殖分化以及凋亡中起着关键作用[4]。近年来，RUNX在免疫中的调节作用也被逐渐揭示，比如RUNX1调节核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)信号通路影响肺部炎症[5]，RUNX3影响Th1/Th2分化[6]。有文献表明RUNX1、3是银屑病的易感基因[7]，还有研究进一步显示RUNX3在银屑病外周血CD4+T细胞高表达[8]，提示RUNX家族分子可能参与银屑病的发病。然而，目前尚无关于RUNX家族在银屑病皮损中表达情况及其与局域免疫相关性的研究。本文通过免疫组化分析RUNX1、2、3在正常人皮肤(healthy control，HC)、慢性湿疹(chronic eczema，CE)、寻常型银屑病(psoriasis vulgaris，PV)皮损中的分布和表达，并利用已发表的芯片数据库进一步分析皮肤RUNX丰度与增殖、凋亡、免疫信号通路的相关性，以期为RUNX在银屑病发病中的作用和机制提供初步理论依据。

1 资料与方法

1.1 病例来源

1.1.2 转录组数据 经Gene Expression Omnibus(GEO)平台下载GSE109248微阵列结果。

1.2 主要试剂、仪器

兔抗人RUNX1、RUNX2抗体(Abcam，英国)，小鼠抗人RUNX3抗体(Abcam，英国)，辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠抗体(中杉金桥，中国)，过氧化物酶封闭液(中杉金桥，中国)，二氨基联苯胺(DAB)显色液(中杉金桥，中国)，10%福尔马林固定液(广州化学试剂厂，中国)，EDTA抗原修复液pH8.0(中杉金桥，中国)，苏木素(中杉金桥，中国)。正置成像显微镜(尼康，日本)。

1.3 实验方法

1.3.1 免疫组织化学(IHC)检测三组皮肤中RUNX1、2、3的表达 将HC、PV和CE的皮损分别经10%福尔马林固定24 h、石蜡包埋。将石蜡包埋皮肤组织制成4 μm切片，置于60 ℃恒温干燥箱烘烤至少2 h，依次经二甲苯、无水乙醇、95%乙醇、70%乙醇脱蜡及水化，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶。EDTA微波法修复后，切片分别滴加抗RUNX1抗体(1 ∶200)、抗RUNX2抗体(1 ∶200)、抗RUNX3抗体(1 ∶40)、抗体稀释液(阴性对照组)，放置在孵育盒内4 ℃冰箱中孵育约12 h，复温后于室温孵育HRP-山羊抗兔(RUNX1、RUNX2组、阴性对照)、HRP-山羊抗小鼠(RUNX3组、阴性对照)二抗30 min，经DAB显色、苏木素复染，盐酸酒精分化，常规脱水、封片。通过显微镜获取图像，经Image-proplus 6.0行灰度转换，通过平均光密度值(mean density，MD)对表皮染色进行半定量分析[9]。

1.3.2 银屑病皮损中RUNX相关基因的GO(gene ontology)富集分析 GSE109248数据库中，利用R语言筛选与RUNX1、2、3的mRNA表达水平分别存在pearson相关性(P<0.05)的基因，依据正、负相关性分为2个基因集，通过R包“clusterProfiler”进行GO富集分析，包括生物过程(BP)、细胞组成(CC)、分子功能(MF)及绘制气泡图，利用R包“ggstatsplot”展示RUNX与重要分子的相关性。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 微阵列数据中RUNX1、2、3在HC和PV皮损中的mRNA表达情况

利用从GEO平台上获得GSE109248的微阵列基因表达数据，比较14例HC和17例PV皮损中RUNX的mRNA表达水平,结果显示，与HC相比，PV皮损中RUNX1呈低表达、RUNX3高表达，而RUNX2的水平在两组皮肤中无统计学差异(图1)。

图1 微阵列数据GSE109248中RUNX1、2、3在健康对照(HC)和银屑病(PV)皮损中的mRNA表达情况Figure 1 The mRNA expression of the RUNX family in skin from healthy controls and psoriasis patients in microarray data GSE109248.

2.2 免疫组化检测RUNX1、2、3在三组皮损中的蛋白表达情况

由图2可见，在健康皮肤中，RUNX1在表皮全层的角质形成细胞、真皮的毛囊和血管内皮细胞、汗腺导管的胞核、胞质均有丰富表达；PV皮损中，RUNX1在表皮的表达显著下降，而在真皮浸润的炎症细胞中高表达；CE也存在表皮RUNX1表达下降，但与PV皮损不同的是，RUNX1在CE的表皮胞核中仍有较丰富的表达，提示RUNX1在两者的表皮细胞内空间分布不同。与RUNX1分布不同，无论是正常皮肤、慢性湿疹还是银屑病，RUNX2、3主要在真皮浸润的炎症细胞表达，而在表皮基底层细胞、真皮的毛囊及血管内皮细胞的胞核中仅散在阳性。通过MD半定量分析表皮中的RUNX，结果发现PV与CE表皮中的RUNX1与HC相比均下降，但前两者之间并无统计学差异。PV表皮RUNX2较正常表皮和CE升高。RUNX3在三组间无差异。

图2 免疫组化检测(100×)RUNX1、2、3在健康对照(HC)、银屑病(PV)和慢性湿疹(CE)皮损中的蛋白表达情况及表皮半定量分析Figure 2 IHC detection (100×) of protein level of RUNX1, 2 and 3 in skin from HC, lesions from PV and chronic eczema and semi-quantitative analysis of epidermis.

2.3 银屑病皮损中RUNX1与凋亡、增殖标志物、Th17相关分子的相关性分析

分析GSE109248中银屑病皮损其他基因的水平与RUNX1的相关性，得到1 176个与RUNX1正相关的基因及1 389个呈负相关的基因。GO富集分析并未得到与银屑病有密切相关的通路(数据未展示)。鉴于RUNX1在表皮丰富表达，且与细胞增殖、分化、凋亡密切相关，分析银屑病皮损中RUNX1与凋亡(BCL2、BAX、CASP3)、增殖和分化相关基因(AREG、TGFA、TGFB3、MKI67、KRT6、KRT16、KRT17、KRT4、KRT10、FLG、LOR、LCE2/3s、WNT家族)的相关性(图3A、3C)，结果表明RUNX1与抗凋亡蛋白BCL2负相关，与WNT2、WNT7B、WNT8A负相关，而与WNT9B正相关。分析RUNX1的水平与T细胞免疫分子的相关性，发现RUNX1与Th17相关细胞因子(IL-17A、IL-17F、IL-17E)呈负相关(图3B)，而与其它Th1、Th2以及Treg基因无明显相关性。

图3 银屑病皮损中RUNX1与凋亡(3A)、Th17相关分子(3B)、增殖标志物(3C)的相关性分析Figure 3 Correlation between RUNX1 and apoptosis(3A), Th17 related markers(3B) and proliferation related markers(3C) in psoriatic lesions.

2.4 银屑病皮损中RUNX3相关基因的GO富集分析

利用相同数据库中与RUNX3有相关性的基因(1 275个正相关基因、900个负相关基因)进行GO富集分析，结果发现RUNX3呈正相关的基因主要富集在T细胞、淋巴细胞的活化和分化等通路(图4A)，而与RUNX3呈负相关的基因集参与负调节WNT通路(图4B)。进一步分析RUNX3与Th1、Th2、Th17/Th22、Treg相关基因的相关性(图4C)，结果表明，RUNX3与Th1通路(STAT4、CXCR3、TNF)、Th17通路(CCR6、IL22)和Treg通路(TGFB、IL-10)呈正相关关系，而与Th2通路基因无相关性。在凋亡、增殖和分化方面(图4C)，RUNX3与银屑病增殖相关的KRT16呈正相关，与KRT6B负相关。

图4 银屑病皮损中RUNX3相关基因的GO富集分析 4A：与RUNX3正相关基因的GO富集分析；4B：与RUNX3负相关基因的GO富集分析；4C：RUNX3与免疫、增殖、分化标志物的相关性分析Figure 4 GO analysis of genes correlated to RUNX3 in psoriatic lesions. 4A: GO analysis of genes positively correlated with RUNX3; 4B: GO analysis of genes negatively correlated with RUNX3; 4C: correlation analysis of RUNX3 with immune, proliferation, and differentiation markers.

3 讨论

RUNX1在多种组织器官上广泛表达，细胞水平上主要定位于细胞核内，在细胞质中也有分布。在LPS诱导的肺上皮炎症中，RUNX1从细胞核转移至细胞质能够拮抗NF-κB信号通路的活化，说明RUNX1在细胞内的分布与其调节炎症功能相关[10]。本研究发现，尽管RUNX1在慢性湿疹和银屑病的表皮中均显著下降，RUNX1在两者的细胞亚定位上不同，提示RUNX1在慢性湿疹和银屑病角质形成细胞中发挥的功能可能有所区别。此外，RUNX1与角质形成细胞的增殖密切相关。既往研究表明，DNp63与p53共同参与下调RUNX1，从而促进角质形成细胞的增殖，基底细胞癌和鳞状细胞癌都存在RUNX1表达失调，前者表现为显著丰富的表达，后者表达相较前者显著减弱[11]。WNT通路在银屑病中发挥重要的致病作用，显著上调的WNT5A参与促进角质形成细胞的增殖[12]和炎症产生[13]。本研究提示RUNX1的表达与WNT2、WNT7B、WNT8A呈负相关，与WNT9B呈正相关。据报道前两者在银屑病皮损中下调[14]，RUNX1与WNT家族的相互关系是否参与角质形成细胞的增殖分化，从而参与银屑病仍有待进一步研究。

RUNX3被认为是重要的免疫调节因子。体外实验表明过表达RUNX3促进正常人来源的CD4+T细胞表达IL-17、IL-22、IL-6等银屑病相关细胞因子，而在银屑病来源的CD4+T细胞中沉默RUNX3可降低Th17、Th22细胞比例[8]，提示RUNX3可能通过促进Th17参与银屑病发病。然而，RUNX3如何调节Th17的机制尚不明确。既往研究提示RUNX可能作为TGF-β的下游[15]或转录因子调控RORγt/AHR[16]，进而影响Th17的分化。而本研究发现RUNX3与 CCR6正相关。CCR6表达于Th17细胞、树突状细胞等免疫细胞表面，介导其向炎症部位迁移[17]。CCR6在银屑病发病中起重要作用，敲除或阻断CCR6均能显著改善小鼠银屑病样皮炎[18]。因此，推测RUNX3通过CCR6调控Th17迁移可能是其参与银屑病发病的机制之一。有研究也证实RUNX3可调节趋化因子受体CCR7影响树突状细胞向肺部引流淋巴结迁徙[19]，说明RUNX3在炎症细胞趋化中发挥作用。下一步将进行体外及体内实验进一步验证RUNX3对T细胞CCR6表达及其迁移、IL-17A表达的影响。

除Th17外，RUNX3也参与Th1、Th2以及Treg的分化或活化。RUNX3能够分别协同转录因子T-bet促进Th1分化[20]、抑制GATA3而抑制Th2分化[21]。在银屑病的CD4+T细胞中，低表达的 miR-138通过上调RUNX3进而提高Th1/Th2比例[6]。RUNX3还是Treg细胞分化、活化的必要条件，RUNX3敲除小鼠的Treg细胞失去抑制肠道炎症和继发肿瘤的能力[22]。本研究发现RUNX3与Treg相关细胞因子TGF-β以及IL-10呈正相关。TGF-β在Treg及Th17的分化中均起到重要作用。研究表明Th0向Th17分化还是Treg分化主要取决于TGF-β的实际浓度以及其它同时存在的细胞因子[23-24]。本研究并未发现RUNX3与Treg细胞的转录因子如FOXP3具备相关性，因此认为在银屑病皮损中RUNX3与TGF-β的正相关性更可能与局部Th17活化相关。同时，研究发现RUNX3与抑炎细胞因子IL-10呈正相关。既往研究也发现IL-10在银屑病皮损中升高，提示IL-10可能扮演负性调控的作用[25]。从转录角度上，IL-10受到NF-κB、干扰素调节因子1(IRF1)和STAT3等促炎因子相关启动子的调控[26]。因此推测RUNX3与IL-10的相关性也是由于IL-10在炎症环境中被负性调控升高所致。总之，RUNX3可能通过多种机制调节不同亚型T细胞的表型和功能，参与银屑病的发病。虽然本研究发现RUNX3与多种T细胞亚群相关细胞因子具有相关性，但RUNX3是否参与银屑病的发病以及其对免疫环境的调节作用，还有待进一步的体内、体外实验进行验证。

KRT6、16、17不仅被认为是银屑病的重要标志分子，且共同参与表皮的增殖、迁移和免疫应答[27-28]。本研究发现RUNX3与KRT16正相关，与KRT6B呈负相关，由于RUNX3在银屑病皮损中主要表达于免疫细胞，因此推测其作为转录因子，可能参与调节免疫细胞的炎症分泌，进而影响角质形成细胞的增殖、分化，其作用及机制有待进一步研究。

综上所述，本研究显示，RUNX1、RUNX2和RUNX3在银屑病皮损中的细胞定位和表达变化各不相同，但银屑病皮损中RUNX1和RUNX3的转录和蛋白水平均较健康对照皮肤出现显著差异；银屑病皮损中RUNX1、RUNX3的转录水平与多种增殖凋亡、T细胞免疫包括Th1、Th17相关信号通路密切相关，但RUNX家族是否影响角质形成细胞和T细胞表型和功能及其具体机制，还需深入研究。