脂肪干细胞外泌体对毛乳头细胞生物学活性的影响

唐鑫， 曹翠香， 梁云霄， 刘敏， 万苗坚

1.中山大学附属第三医院，广东 广州 510630；2.南方医科大学皮肤病医院，广东 广州 510091

脱发影响全球一半以上人口，对患者的生活质量和社会心理健康有着严重的影响[1]。目前，美国食品药品监督管理局(food and drug administration， FDA)批准的两种治疗脱发的药物(口服非那雄胺和局部外用米诺地尔)存在不良反应及停药后易复发等局限性[2]。脱发的治疗仍然是世界性难题和研究的热点。间充质干细胞 (mesenchymal stem cells， MSCs)是一类具有自我更新及多向分化潜能的成体干细胞，可来源于骨髓、脂肪、脐带等,具有高度的自我更新、多向分化及免疫调节能力。其中，ADSCs 取材来源广泛，容易获取及分离培养,并具有促进细胞再生等功能。外泌体(exosomes,Exos)是一类直径大小约为30～150 nm膜性囊泡,可由绝大多数细胞分泌产生, 可通过其包裹的脂类、核酸、蛋白质等参与细胞间通讯，调节细胞生物活性。MSCs外泌体广泛应用于再生医学领域,如营养神经组织、促进伤口愈合、改善血管再生等[3-4]。最近的研究表明多种细胞来源的Exos参与了毛囊生理和周期循环过程中发生的细胞间通讯，能够刺激毛发的生长[5-10]。真皮毛乳头细胞(dermal papilla cells，DPCs)是一群毛球部的间充质细胞，是毛囊生长和周期调节的关键环节之一，提供毛囊生长所必需信号及决定毛囊的分化方向，毛囊诱导能力是DPCs的特殊功能[11-12]。目前脂肪干细胞外泌体(adipose-derived stem cell exosomes，ADSC-Exos) 对毛乳头细胞影响的研究较少[13-14]。本研究通过初步探究ADSC-Exo对毛乳头细胞增殖和诱导能力的影响，从而探讨脱发治疗新思路。

1 材料与方法

1.1 实验主要试剂

胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、DMEM培养基、PBS、0.25%胰蛋白酶、青-链霉素(Gibco，美国)；CD9、TSG101、calnexin、β-catenin、versican、ALP、GAPDH抗体(abcam，美国)；人毛乳头细胞、间充质干细胞培养基(ScienCell，美国)；0.2%胶原酶Ⅰ(BioFroxx，德国)； 成脂、成软骨培养基(Cyagen，中国)；PKH67染料(Sigma，美国)；BCA蛋白浓度试剂盒(Thermo Fisher Scientific，美国)； CCK-8试剂盒(DOJINDO，日本);SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad，美国)；4%多聚甲醛溶液、细胞冻存液、全蛋白提取试剂盒(凯基生物，中国)；化学发光液(艾菲，中国)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与鉴定 ADSCs: 收集大腿抽脂术后多余的废弃脂肪组织(28岁健康女性志愿者，已签署知情同意书， 且通过中山大学附属第三医院伦理委员会批准)。用含1%青-链霉素双抗的PBS洗涤3次，去除血液及多余杂质，用无菌镊子去除较大的纤维组织,并用眼科剪剪碎脂肪组织，转移至离心管中，加入等体积的0.2% Ⅰ型胶原酶，37 ℃水浴振荡至管中组织呈乳糜状(约30 min)，加入等体积的含10% FBS的低糖DMEM完全培养基终止消化，1 000 r/min, 离心3 min，轻轻吸掉最上层的脂肪及中层上清液，保留下层沉淀，用含有体积分数为10% FBS及1%青-链霉素的DMEM低糖完全培养基重悬，接种于细胞培养瓶，置于37 ℃、5%的CO2培养箱中。细胞融合度约90%时，进行传代培养，本研究使用第3代脂肪干细胞。诱导分化及免疫荧光染色法检测ADSCs表面标记物对ADSCs进行鉴定。

DPCs:购于美国ScienCell 公司，按照说明书配制间充质干细胞培养基，加入胎牛血清、青霉素-链霉素及间充质干细胞生长因子，置于 37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.2.2 外泌体提取与鉴定 用低糖DMEM完全培养基培养第三代的ADSCs,待其融合度达80%～90%时，更换无外泌体血清低糖DMEM培养基处理48 h，收集培养上清，按照超速离心法步骤进行离心提取外泌体，最后用预冷PBS重悬ADSC-Exos,所收集的外泌体置于-80 ℃冰箱中储存备用。用纳米颗粒粒度分析仪(nanoparticle tracking analysis, NTA)检测粒径大小和浓度；透射电镜(transmission electron microscope, TEM)分析ADSCs-Exos形态特征；蛋白免疫印迹检测外泌体表面标记物[15]。

1.2.3 细胞增殖检测 DPCs接种于96孔板，5 000 cells/孔,待细胞贴壁后加入外泌体处理，48 h后每孔加入10 μL CCK-8试剂，37 ℃孵育2 h, 测量吸光度值并计算细胞活力。

1.2.4 蛋白免疫印迹 用适量细胞裂解液提取各组细胞蛋白并测定其蛋白浓度，进行凝胶电泳，电泳完成后恒流转膜，室温封闭1 h。1×TBST 洗膜4遍，每次8 min，加入相应一抗置于4 ℃过夜，吸走一抗，用1×TBST 洗膜4遍，每次8 min，加入二抗孵育 1 h，1×TBST 洗膜 4遍，每次8 min。用化学发光液显色发光，使用Image J软件进行蛋白质灰度分析。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 脂肪间充质干细胞鉴定

如图1所示：镜下ADSCs呈长梭形，排列紧密；分化实验中，ADSCs顺利向成脂和成软骨诱导分化，体现其具有多向分化的干细胞潜能。免疫荧光提示ADSCs表达CD13、CD29、CD44和CD90等间充质干细胞标记物,不表达CD34、ISO等阴性标记物 (图2)。

图1 ADSCs镜下形态及分化实验Figure 1 Identification of ADSCs.

图2 免疫荧光染色法检测ADSCs表面标记物(100×)Figure 2 Immunofluorescence staining was used to detect the surface markers of ADSCs (100×).

2.2 外泌体提取与鉴定

透射电镜下外泌体形态完整、大小均一，呈圆杯形(图3A)； 蛋白免疫印迹显示:与ADSCs细胞裂解蛋白相比，外泌体高表达 TSG101和CD9的典型表面标记物，不表达细胞质内质网蛋白calnexin(图3B)；纳米颗粒追踪分析(NTA)外泌体粒径大小为30 ～ 150 nm，平均粒径为66.00 nm(图3C)，表明本研究成功提取脂肪干细胞外泌体。

图3 脂肪干细胞外泌体的特征 3A：透射电镜图像(比例尺100 nm)；3B：CD9、TSG101和calnexin蛋白免疫印迹检测；3C： NTA测量的外泌体粒径大小分布Figure 3 Characteristics of adipose-derived stem cell exosomes. 3A: TEM image, scale bar 100 nm；3B: Western blot detection of CD9, TSG101 and calnexin proteins；3C: Particle size distribution of exosomes measured by NTA.

2.3 ADSC-Exos促进DPCs增殖，增强毛囊诱导能力

采用荧光染料PKH67标记ADSC-Exos，分别用加和未加PKH67标记的ADSC-Exos与DPCs孵育，激光共聚焦荧光显微镜观察到绿色荧光的ADSC-Exos在DPCs内分布，即ADSC-Exos被成功摄取(图4A),表明ADSC-Exos可有效内化到DPCs中。

将ADSC-Exos与DPCs共培养48 h，DPCs细胞数量及密度明显增加(图4B)。CCK-8结果显示,与对照组相比，ADSC-Exos对DPCs增殖明显促进(t=14.38，P<0.01，图4C)。提取各组细胞总蛋白进行毛囊诱导能力相关蛋白ALP及Versican检测，以 GAPDH为内参进行均一化处理，外泌体组的ALP蛋白相对表达量是对照组的1.47倍(t=7.75，P<0.01)，Versican蛋白相对表达量是对照组的1.95倍(t=29.34，P<0.01)，提示ADSC-Exos可以上调DPCs的ALP和Versica蛋白的表达(图4D、4E)，DPCs的诱导能力显著提高。

图4 ADSC-Exos对DPC生物活性的影响 4A：分别用加和未加PKH67标记的ADSC-Exos与DPCs孵育，ADSC-Exos可被DPCs摄取吸收，PKH67为绿色荧光，细胞核被DAPI染为蓝色(200×，比例尺:50 μm)； 4B：ADSC-Exos与DPCs共培养细胞图，以PBS为对照(100×，比例尺:100 μm)； 4C：ADSC-Exos促进DPCs增殖；4D:ADSC-Exos处理DPCs后 ALP 和 Versican蛋白表达的变化；4E：蛋白条带灰度定量图Figure 4 Effect of ADSC-Exos on DPC bioactivity. 4A: ADSC-Exos was labeled with PKH67 and absorbed by DPC. PBS was used as negative control, PKH67 was green fluorescence, and the nucleus was stained blue by DAPI (200×, scale:50 μm); 4B: Map of ADSC-Exos and DPCs co-cultured cells, PBS as control(100×， scale:100 μm); 4C: ADSC-Exos promotes DPCs proliferation; 4D: Changes of ALP and Versican protein expression after ADSC-Exos treatment of DPCs; 4E: gray scale quantitative map of protein bands.

3 讨论

脱发日益成为危害全球男女身心健康的疾病，亟需开发效果显著、持久且副作用小的治疗方法。外泌体作为细胞通讯的介质，通过转移各种生物活性物质核酸、蛋白质和脂类等去调节目的细胞或参与组织再生，并且保持与来源细胞相同的生物活性[16]。干细胞移植在治疗疾病方面具有巨大的潜力，ADSCs最近成为一种极具吸引力的间充质细胞类型。本研究成功地从ADSCs细胞培养基中分离出了外泌体，同时，使用PKH67荧光标记的外泌体证明DPCs顺利摄取ADSC-Exos。将ADSC-Exos与DPCs共培养发现,ADSC-Exos促进DPCs增殖，上调ALP和Versican蛋白的表达。

研究表明，ADSCs可分泌各种生长因子，利用脂肪来源的干细胞、条件培养基及富含ADSCs的血管基质成分(stromal vascular fraction, SVF)在脱发治疗领域应用的治疗方法已被不断报道[17-19]，但既往对脂肪干细胞促进毛发生长的研究主要是细胞以及条件培养基，存在干细胞及培养基治疗的局限性，如免疫排斥、存活时间短、总体含量低等缺点。本研究通过酶消法从脂肪组织分离出ADSCs，在体外进行培养及传代，原代脂肪干细胞形态为梭形，高表达间充质干细胞相关阳性表面标记物，并向成脂及成软骨诱导分化等多向分化潜能。通过超速离心法获取外泌体，电镜下外泌体形态呈圆杯形；粒径在30～150 nm；高表达CD9、CD81等外泌体标记物，不表达内质网特异蛋白Calnaxin，均与以往报道的研究结果[20-21]较一致，表明本实验成功分离培养ADSCs并获取未受细胞器污染的较纯的ADSC-Exos。因此，本研究中使用的ADSC-Exos具有大量生产、伦理限制少的优势，可克服干细胞及其条件培养基的局限性，利于后续进行临床转化治疗及开展组织工程研究。

DPCs作为毛囊生长的信号指导中心，通过分泌信号因子来调控毛囊的周期，其生物活性变化与毛囊生长及周期调控息息相关。其中，ALP及Versican作为DPCs的重要标记物及诱导能力指标，在生长期毛囊真皮乳头中特异性高表达ALP及Versican可诱导毛囊形成，晚期传代的DPCs失去诱导活性，无法产生毛囊而导致脱发[22-25]。因此，促进DPCs增殖和恢复DPCs的毛发诱导能力将是一种很有希望的治疗脱发的方法。本实验采用DPCs作为研究对象，通过观察 DPCs经过处理前后细胞增殖和毛囊诱导能力的变化，进而判断DPCs生物活性的改变。DPCs的增殖和毛发诱导能力是毛囊形态发生和生长所必需的。本研究发现外泌体组DPCs增殖活性增加，外泌体组ALP和Versican蛋白表达明显高于对照组，说明ADSC-Exos可改善DPCs的毛囊诱导能力，诱导DPCs向生长期转化,进而促进毛发生长。这与骨髓间充质干细胞来源的外泌体可促进毛乳头细胞增殖和增强诱导能力的研究结果[26]一致。 同时，也有研究表明，脂肪干细胞、ADSCs条件培养基以及富含ADSCs的血管基质成分(stromal vascular fraction，SVF)可治疗脱发，促进毛发再生[27-28]，ADSC-Exos作为脂肪干细胞及其条件培养基的重要活性成分同样具有促毛发生长的特性。最近研究表明，ADSC-Exos促进毛发重建和再生[13-14,29]。小鼠ADSC-Exos与真表皮细胞混合物移植至裸鼠背部后有利于毛发再生，但因研究的细胞成分较复杂，难以明确ADSC-Exos的作用对象[29]。小鼠ADSC-Exos可促进小鼠触须DPCs的增殖、迁移和抑制其凋亡，并通过调节Wnt/β-catenin信号通路和TNF-α信号通路促进毛发再生[13]，与本结果类似，但未进行DPCs诱导能力相关探究，而且本研究使用人源ADSC-Exos及人头皮DPCs进行毛发生长研究，更能接近人体实际情况。此外，研究发现ADSC-Exos促进DPCs增殖迁移，在转录水平上调ALP及Versican的基因表达[14]，而本研究则在蛋白水平探讨ADSC-Exos上调ALP和Versican蛋白表达，从而维持DPCs在体外毛发诱导能力,不仅印证了该研究结果，而且在不同水平上补充和完善了ADSC-Exos对DPCs毛发诱导能力影响的探究。

综上所述，本研究通过体外实验初步探讨ADSC-Exos对DPCs生物活性的影响,发现ADSC-Exos促进DPCs增殖，增强其毛发诱导能力，发挥诱导毛发生长的作用，提示ADSC-Exos有望为脱发提供一种新的无细胞治疗策略。但本研究仅涉及细胞水平的研究，在毛囊器官、体内动物水平上有待进一步加以证实，且ADSC-Exos参与毛囊生长的具体作用机制仍需后续实验加以验证。