几种植物组合物对雄激素性脱发的探索与调控机制研究

张文云 张兵 罗剑芳 何健 容宝珊 艾勇 何廷刚 张蓝月

探究由甘草苷、当归、花椒、苦参、连翘、波尔多树叶、齐墩果酸、二苯乙烯苷植物组合物对雄激素性脱发小鼠的改善效果。首先利用5 mg/kg 丙酸睾酮处理小鼠背部脱毛，建立脂溢性脱发模型，并将 C57BL/6J 小鼠随机分为6组，即空白组、模型组、米诺地尔组、5%组合物组、15%组合物组、45%组合物组，分别在脱毛区涂抹相对应的处理物质。通过 HE 组织学观察小鼠终毛与毳毛的比例，免疫组化测定皮肤中 TGF-β1和 TNF-α的含量， ELISA 测定皮肤组织中二氢睾酮和5ɑ-还原酶的含量。结果表明，相对于模型组，植物组合物都可以提高小鼠终毛/毳毛比例，降低小鼠体内 TGF-β1和 TNF-α的蛋白表達量和小鼠皮肤中二氢睾酮和5α-还原酶的含量。因此，该植物提取组合物对于雄激素性脱发有一定的缓解能力，能够提高终毛/毳毛比例，可以为开发预防雄激素性脱发植物组合物的日用品提供一定理论指导。

关键词：植物组合物；毛发生长；5ɑ-还原酶。

雄激素性脱发（androgenic alopecia， AGA），又称为脂溢性脱发（Seborrheic alopecia， SA），是一种主要发病群体为20～40岁的男性，呈年轻化发展趋势，备受关注[1，2]。AGA 发病表现为头发密度进行性减少、头发油腻、头部皮肤瘙痒、多屑等，对患者的日常生活和思想情绪等造成严重影响。AGA 的产生是多种内在和外在因素共同作用的结果，其中主要因素是由家族遗传易感染患病性和机体头皮毛囊处局部雄激素（Testosterone，T） 与雌激素（Estrogen，E2） 的代谢平衡失调造成[3-5]。作用机理在目前的研究来看，T 是一种男性机体体内主要的雄性激素，在5α-还原酶介导代谢作用下生成二氢睾酮（Dihydrotestosterone，DHT），其中 T 和 DHT 都可与雄激素受体（Androgen receptor，AR） 结合，但 AR 与 DHT 的选择结合性比 T 高，所以 AGA 与5α-还原酶活性有相当重要的关系，最后雄激素受体复合物进入到细胞核与染色质结合，使终毛向毫毛转化的相关基因活化，大量分泌 TGF-β1和 TNF-α，进而诱发毛囊微型化，导致头部发生脱发。从目前的研究发现它的发病机理与 T 及其代谢产物 DHT 浓度水平、头部头皮毛囊单位的Ⅱ型5ɑ-还原酶活性与数量和 AR 的活性水平有直接的相关性[6-10]。

针对诱发机理，在目前治疗雄激素性脱发的手段主要是药物治疗和毛发移植。药物治疗的药物类型主要有5ɑ-还原酶抑制剂、AR 阻断剂、抗 T 药、钾离子通道开放剂和 E2类药物等，但这些药物很可能过分干扰机体正常分泌代谢物质，致使机体容易出现不良反应，常有一定程度的多毛症、性功能障碍等，并且不能完全治愈，也无法诱导毛囊再生提高毛囊数量和生长能力[10]。因此寻找一种安全有效、副作用小、可以有效平衡头部头皮毛囊 T 与 E2的平衡、使用方便的植物提取物十分重要。我国中草药众多，其中当归、苦参、齐墩果酸、二苯乙烯苷等中药都有证实对 AGA 有一定的缓解效果[11-13]。所以本实验建立小鼠雄激素性脱发模型，测试由甘草苷、当归、连翘、苦参、花椒、波尔多树叶、齐墩果酸、二苯乙烯苷组成的植物提取物对 AGA 的调控效果，并找出适合促进毛囊再生的植物提取物组合物，为缓解脱发的植物提取物的日用品的开发提供一定的理论指导。

1 材料和方法

1.1. 动物

鼠龄为5周龄的雄性 C57BL/6J 小鼠，60只，等级 SPF 级，体重位于22-24g，购于广州中医药大学实验动物中心，合格证号：SCXK（粤）20130034。

1.2.实验耗材

中药组合物（甘草苷、当归、花椒、苦参、连翘、波尔多树叶、齐墩果酸、二苯乙烯苷）、丙酸睾酮注射液（1 mL：25 mg，10支/盒）、5%米诺地尔酊（绵竹，四川美大康华康药业有限公司），耳标、1 mL 射器（若干）、4%多聚甲醛、HE 试剂（无水乙醇、二甲苯、苏木素-伊红染液、组化液、氨水、性树胶）、小鼠双氢睾酮（DHT）ELISA 试剂盒（货号 SMK3267A，江苏酶标生物科技有限公司）、小鼠5α-还原酶（5AR） ELISA 试剂盒（货号 SMK5986A，江苏酶标生物科技有限公司）、Anti-TGFB1 Rabbit pAb（货号 GB13028，免疫组化稀释度1：50，武汉赛维尔生物科技有限公司）。

1.3.实验分组、造模与涂抹

将60只 C57BL/6J 小鼠平均随机分为6组，即空白组、模型组、米诺地尔组、5%组合物组、15%组合物组、45%组合物组。在造模前，适应性饲养所有小鼠于温度

（23±2）℃，湿度（54±10）%的环境中，自由饮食、饮水一周。一周后进行造模，对空白组和非空白组的小鼠背部分别给予皮下注射生理盐水和5mg/kg 丙酸睾酮，并持续4周，每天一次。

实验给药4周观察小鼠毛发生长情况，建模成功后，进行后续实验处理，在每只小鼠的背部皮肤上，模型组和空白组采取涂抹0.9%氯化钠水溶液，米诺地尔组涂抹5%米诺地尔酊0.2mL/d，组合物组涂抹对应浓度的植物提取物组合物，每日1次，周期4周。

1.4.HE 组织学观察

处理28天后，快速处死小鼠，取各组每只小鼠背部脱发区约1cm×1cm 大小的皮肤，置生理盐水中充分漂洗残余血液，铺展于滤纸上，室温晾干，用锡箔纸上包好放入装有4%多聚甲醛溶液的离心管中进行组织固定。固定24至48小时后，将皮肤组织取出，依次放入75%、85%、90%、95%、100%乙醇和二甲苯1、二甲苯2中脱水。然后将皮肤组织置于包埋机中进行包埋，包埋后得到的蜡块进行石蜡切片脱蜡、苏木精-伊红染色和脱水封片。在100倍显微镜视野下，平均3个不重叠的视野下，观察小鼠毛囊形态学变化，利用 Image- Pro Plus 测量毛囊长度及其大小，统计生长期毛囊数量与休止期毛囊数量比值（A/T）。

1.5.免疫组化检测对小鼠皮肤中TGF-β1和TNF-α的含量测试

每只小鼠取材2.0cm×0.8cm 长条状皮肤，与1.4中相同方法处理皮肤组织，按照 Anti-TGFβ1 Rabbit pAb的使用方法进行免疫组化实验来判断小鼠皮肤中 TGF-β1和 TNF-α的表达情况。由于二氨基联苯胺（DAB） 是辣根过氧化物酶（HRP） 的底物，在 HRP 的催化下，DAB 产生棕色沉淀。因此，可以通过观察小鼠组织切片是否呈现棕色来判断是否存在DHT 或5α-还原酶。使用 Image- Pro Plus 软件测量免疫组化染色后的小鼠皮肤 tyrosinase、 VEGF、β-catenin 的 IOD 值，收集数据，计算其均值。

1.6.ELISA 测定皮肤组织中二氢睾酮（DHT）和5ɑ-还原酶的含量

将每只小鼠经解剖采集的小鼠组织，制备组织匀浆，按 ELISA 试剂盒说明书上的方法测定各组小鼠组织中 DHT 和5α-还原酶含量，记录数据，求其均值。

1.7.统计学分析方法

采用 GraphPad Prism 绘制柱状图并用软件中的单因素方差检验对数据进行显著性比较，以 P<0.05，*表示有统计学意义。

2结果

2.1. 毛囊形态学观察

与模型组对比，空白组视野内终毛占总发量较大，且毛囊密度较高，毳毛在视野中几乎没有，具有显著性差异。与其他组对比，模型组总体毛囊密度小，数量少，毳毛占总毛发较多，表明造模成功。对于米诺地尔组，显微视野中，终毛占总发量较大，毳毛占比較小。在各组合物组中终毛/毳毛值比值最高的是15%组合物组，毛囊密度高，视野里基本都是终毛，毳毛数量较少，具体见图1，图2。

2.2.小鼠皮肤中 TGF-β1和 TNF-α的含量

本实验表明雄激素可诱导小鼠对应细胞合成及分泌 TGF-β1，导致小鼠体内的 TGF-β1的含量提高，致使小鼠头部毛囊角质形成细胞表现出增殖受抑制作用的表现。分析本次实验各组数据，如图3，在经过造模后，与模型组对比，空白组中的 TGF-β1含量有了明显的降低（P ＜0.01），随后经过给药实验米诺地尔和5%组合物与模型组相比能够极显著抑制 TGF-β1的表达（P ＜0.01）。此外， 15%组合物组和45%组合物组也能显著地抑制 TGF-β1的表达（P ＜0.05）。

本实验表明雄激素可诱导小鼠对应细胞合成及分泌 TNF-α，导致小鼠体内的 TNF-α的含量提高，致使小鼠头部毛囊角质形成细胞表现出增殖受抑制作用的表现。在经过造模后，与模型组对比，空白组中的 TNF-α含量有了明显的降低（P ＜0.01），随后经过实验米诺地尔组、15%组合物和45%组合物与模型组相比能够极显著有效降低 TNF-α的表达（P ＜0.01）； 5%组合物组能显著降低小鼠体内的 TNF-α含量（P ＜0.05），见图4。

2.3.皮肤组织中 DHT 的含量研究

根据本次 ELISA 对皮肤组织中 DHT 的含量数据可知，经过造模以后，模型组、米诺地尔组和5%、15%、45%组合物组小鼠皮肤组织中的 DHT 含量与空白组相比较都有明显升高；而给药以后，米诺地尔组和5%、15%、45%组合物组小鼠皮肤组织中的 DHT 含量与模型组相比都有不同程度的下降，见图5。

根据本次 ELISA 对皮肤组织中5α-还原酶的实验数据可知，与模型组相比，空白组小鼠中5α-还原酶的浓度显著降低（P ＜0.05）；与模型组相比，米诺地尔和5%和15%的低浓度组合物组缓解雄激素性脱发的效果但不存

在统计学差异，且这三组的缓解能力效果相当，改善并降低了5α-还原酶在小鼠头部皮肤组织中浓度含量，而高浓度45%组合物组提高了小鼠皮肤组织中的5α-还原酶的含量，见图6。

3讨论

AGA 是由机体体内 T 与 E2 的平衡失调上升，大量T 在 5α- 还原酶介导作用下转化为 DHT，进而致使大量DHT 与小鼠体内的 AR 结合，提高 TGF-β1 和 TNF-α 的蛋白表达，诱发小鼠毛囊微型化，导致头部发生脱发，甚至是永久性脱发 [14-19]。所以本研究将测定小鼠毛囊生长情况和体内的 TNF-α、TGF-β1、DHT 和 5α- 还原酶的浓度情况来评价该天然植物提取组合物对小鼠的雄激素脱发的药物缓解效果。

本实验探究通过向小鼠注射睾酮进而诱导小鼠建立雄激素脱发模型，并采取 HE 组织学观察，发现终毛占比低，毛囊密度减少，表明小鼠模型建立成功（P<0.01）。实验结果显示，通过毛囊形态学观察可知，相对于模型组，各浓度组合物组都能够有效改善睾酮导致的毛囊减小和减少现象，提高小鼠终毛/毳毛的比例，其中15%组合物组比其他两组的预防缓解效果更好。从分子水平观察实验数据，相对于模型组，组合物组小鼠体内 TGF-β1的含量下降情况，各浓度组合物组都有一定缓解效果（5%组合物组，P<0.01；其他处理组，P<0.05），明显具有显著性差异，且对比米诺地尔组，5%组合物组表现出的缓解效果更好。在 TNF-α的含量浓度下降研究中，相对于模型组，各浓度组合物组表现出良好的预防缓解效果（5%组合物组，P<0.05；其他处理组，P<0.01），具有显著性差异，能够有效地大量降低小鼠体内的 TNF-α含量，其中45%组合物组相对于米诺地尔组和其他组合物组表现缓解病症效果更好。在 ELISA 测定小鼠皮肤组织中 DHT 和5α-还原酶的含量实验数据，相对于模型组，我们发现该低浓度天然植物提取组合物和对小鼠体内的 DHT 含量和5α-还原酶的含量水平有一定的下降效果，高浓度的组合物可以提高小鼠体内的 DHT 含量和5α-还原酶的含量水平，但与模型组相比无显著性差异。

4结论

本实验结果显示由甘草苷、当归、连翘、苦参、花椒、波尔多树叶、齐墩果酸、二苯乙烯苷组成的组合物通过抑制小鼠皮肤细胞有关 TGF-β1和 TNF-α的蛋白代谢生成，进而抑制小鼠的终毛向毳毛转化的相关基因活化，最终达到缓解雄激素性脱发的目的，与米诺地尔表现出的临床表现类似，所以我们推测其和米诺地尔的作用机理有些许相似，比如增加局部血供，促进毛细血管开放等等，作用机制还需进一步研究。在运用方面，可以为研究针对雄激素脱发的天然植物洗发水方面提供理论参考。

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