芳樟醇对三文鱼源莓实假单胞菌的抑菌机理

梅佳林，李婷婷，张星晖，励建荣,*，孟玉琼，马 睿，杨 旭

（1.渤海大学食品科学与工程学院，辽宁 锦州 121013；2.大连民族大学生命科学学院，辽宁 大连 116600；3.青海大学生态环境工程学院，青海 西宁 810016；4.民泽龙羊峡生态水殖有限公司，青海 海南 811800）

高通量测序（high-throughput sequencing，HTS）能直接从样品中提取DNA，并同时对数百万个基因样本进行测序分析，有效地避免了传统微生物分离、培养的繁琐过程和可能造成的污染[1]。HTS在检测不可培养微生物和低丰度微生物方面有其独到之处，为全面描述细菌群落动态、分析微生物代谢途径与腐败菌之间的相关性提供了可靠的方法[2]。与传统的Sanger法测序相比，HTS耗时更短、精准度更高、且成本更为低廉[3]。目前，HTS已应用于食品领域的许多研究中，如传统发酵鲅鱼[4]、鸡肉[5]、猪肉[6]等。Cai Luyun等[7]利用微波或远红外解冻红鲷鱼片并研究解冻技术对微生物多样性的影响，发现解冻方式对微生物优势菌群影响较小，贮藏前期假单胞菌属是其主要菌属，贮藏24 h以后，芽孢杆菌的比例显著增加，也成为红鲷鱼片的优势菌群。

芳樟醇是一些芳香植物精油，如薰衣草精油、芳樟精油的主要成分之一[8]，常被作为芳香剂和调味剂添加到洗涤剂和食品中，每年全球总消费量超过1 000 t[9]。芳樟醇还被美国食品和药品管理局归类为“公认安全”（generally recognized as safe，GRAS）物质，联合国粮食及农业组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会确定了芳樟醇的每日允许摄入量（acceptable daily intake，ADI）为0～0.5 mg/kgmb[10]。芳樟醇除了简单的调香调味功能之外，还具有抗菌[11]、抗炎症、抗肿瘤[12]、抗高血压[13]、预防神经退行性疾病（阿尔茨海默病等）[14-15]等功效。

莓实假单胞菌（Pseudomonas fragi）广泛存在于各种冷藏食品中，已有大量文献报道莓实假单胞菌是肉品、海产品和乳制品中的优势腐败菌，极易导致食品腐败变质，且随着时间的推移，莓实假单胞菌在食品菌相体系中的优势地位更加明显[16-17]。鉴于前人对莓实假单胞菌的研究较少，且相关研究大多集中于畜禽肉类，水产品尤其是三文鱼中莓实假单胞菌的相关报道较少见，且鲜有探究芳樟醇对三文鱼源莓实假单胞菌的抑菌活性及机理的研究，因此，本实验应用HTS分析不同贮藏期三文鱼的菌相变化，再以提取自三文鱼中的莓实假单胞菌MS 02为靶细菌，研究芳樟醇对其抑菌性能及作用机制。本研究利用细菌生长曲线表征芳樟醇对莓实假单胞菌的抑菌效果，通过扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）观察菌体的微观形态变化，通过测定细菌细胞膜的通透性、完整性、菌体内碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）和钠钾ATP酶活力来分析芳樟醇的抗菌机制，为芳樟醇作为天然抑菌剂对三文鱼保鲜提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

三文鱼购自辽宁省大连市麦德龙水产市场，原产地法罗群岛。

芳樟醇（纯度大于98%） 上海源叶生物科技有限公司；TaqPCR Master Mix试剂盒 上海生工生物工程有限公司；AKP测试盒、超微量ATP酶（Na＋K＋-ATP酶）测试盒 南京建成生物工程研究所；二乙酸荧光素（fluorescein diacetate，FDA） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；平板计数琼脂（plate count agar，PCA）培养基、LB肉汤 青岛海博生物科技有限公司；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.2、1×）、戊二醛 北京索莱宝生物科技有限公司；氨苄青霉素国药集团化学试剂有限公司；甲醇 天津福晨化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-2FD超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司；LRH-250A生化培养箱 上海一恒科技有限公司；Victor X3酶标仪 美国Perkin Elmer公司；Legend Micro21R微量冷冻离心机 美国赛默飞世尔科技公司；MS-105DU电子分析天平、LE703电导率仪 瑞士梅特勒托利多仪器有限公司；cs 150 gx3超速离心机、F7000荧光分光光度计 日本日立公司；MLS-3030CH立式高压蒸汽灭菌锅 日本三洋公司；THZ-D台式恒温振荡箱太仓市实验设备厂；SCIENTA-IID超声波细胞粉碎器宁波新芝生物科技公司。

1.3 方法

1.3.1 三文鱼样品的预处理和高通量测序

三文鱼捕捞后立即宰杀放血去内脏，经液氮速冻后空运至辽宁，取三文鱼腹部鱼肉，干冰冷冻保藏运输至本实验室。将三文鱼分割成若干个质量为10 g的鱼块（2 cmh2 cmh2 cm），放入无菌培养皿内，用3 层保鲜膜密封，置于冰箱内于4 ℃下保存，分别于第0、3、6、9、12天取样，样品取出后立刻放入－80 ℃冰箱中保存，取样结束后将样品送至天津诺禾致源生物信息科技有限公司进行HTS分析，样品在干冰环境中贮运。样品经过DNA提取、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增及纯化、系统数据库的建立及测序后，得到原始数据，处理后得到有效数据，基于有效数据进行可操作单元（operational taxonomic units，OTUs）聚类和物种分类分析。

1.3.2 三文鱼优势腐败菌的分离、纯化及鉴定

选取4 ℃贮藏12 d的腐败三文鱼块进行微生物菌群结构鉴定。将10 g鱼肉倒入无菌蒸煮袋中，加入90 mL无菌生理盐水，匀速拍打2 min制成菌悬液，10 倍梯度稀释后取1 mL稀释液涂布于PCA培养基表面，每个稀释梯度设置3 个平行。选取菌落总数为30～300的平板，观察菌落特征后，挑取平板上大小、形态、隆起程度、光泽度及颜色等不同的菌落接种于LB肉汤中，28 ℃振荡培养12 h，然后在PCA培养基上划线，于28 ℃培养24 h，重复2～3 次，再挑取单菌落接种于LB肉汤中，28 ℃培养12 h，以10%（体积分数）接种量传代培养12 h至对数生长期，最后将对数生长期菌液与等体积的50%（体积分数）甘油水溶液混匀，置于－80 ℃冰箱中冻存保藏菌种。

将－80 ℃下保藏的菌种按照10%（体积分数）的接种量加入LB肉汤中，28 ℃培养24 h进行活化，传代培养两次后，取1 mL对数生长期菌液（107CFU/mL）到1.5 mL离心管中，在室温下6 000 r/min离心5 min，收集菌体，用100 µL无菌水重悬，再使用PCR仪提取细菌DNA（94 ℃、40 min），随后在室温下以6 000 r/min离心5 min，收集上清液在－20 ℃下保存。参考文献[18]制备PCR扩增体系扩增细菌DNA，50 µL体系组分为：1 μL DNA样品；2 μL上、下游引物（10 μmol/L）；25 μLTaqPCR Master Mix（2×）和20 µL无菌水。PCR程序：94 ℃、5 min；94 ℃、40 s，54 ℃、40 s，72 ℃、1 min，30 个循环；72 ℃、5 min；4 ℃至反应完成。

将PCR扩增产物送至上海生工生物工程股份有限公司检测基因序列。将测序得到的基因序列与NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中已知微生物基因序列进行BLAST比对分析，采用MEGA 5分析16S rRNA结果，采用Neighor-Joining法构建系统发育树。

1.3.3 芳樟醇对莓实假单胞菌的抑菌性测定

1.3.3.1 芳樟醇最小抑菌浓度的测定

参考文献[19]采用96 孔板稀释法测定芳樟醇对莓实假单胞菌MS 02的最小抑菌质量浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）。将适量芳樟醇溶解于50%（体积分数，下同）甲醇溶液，配制质量浓度为8.00 μg/mL的芳樟醇母液，采用二倍梯度稀释法用50%甲醇溶液稀释制得质量浓度分别为4.00、2.00、1.00、0.50 μg/mL的芳樟醇溶液备用。按照100 μL/孔向96 孔细胞培养板中加入活化两次后处于对数生长期的菌液（107CFU/mL），再分别按照100 μL/孔加入不同质量浓度的芳樟醇溶液（终质量浓度分别为4.00、2.00、1.00、0.50、0.25 μg/mL），分别以等体积的50 μg/mL氨苄青霉素、50%甲醇溶液作为阳性对照和空白对照，每组3 个平行。将96 孔板置于28 ℃细菌培养箱培养12 h，再用酶标仪于595 nm波长处测定光密度值OD595 nm，选择OD595nm低于阳性对照组的最低质量浓度作为芳樟醇对莓实假单胞菌的MIC。

1.3.3.2 莓实假单胞菌MS 02生长曲线的测定

采用抑菌曲线法评价芳樟醇对莓实假单胞菌MS 02的抑菌效果。取－80 ℃下保藏的莓实假单胞菌MS 02菌种，参考1.3.2节方法进行活化，传代培养两次后吸取500 μL对数生长期的菌悬液（107CFU/mL）加入到25 mL LB肉汤当中，充分振荡均匀后再分别按照终质量浓度MIC、2 MIC加入芳樟醇溶液，以等体积50%甲醇溶液作空白对照，在28 ℃、160 r/min的摇床中培养24 h，每隔2 h取样，使用酶标仪测定菌液595 nm处的光密度值OD595 nm。

1.3.3.3 莓实假单胞菌MS 02形态观察

参考文献[20]采用SEM观察莓实假单胞菌MS 02细胞形态变化。取－80 ℃下保藏的莓实假单胞菌MS 02菌种，参考1.3.2节方法进行活化，传代培养两次后向对数生长期的菌悬液（107CFU/mL）中加入芳樟醇，使菌悬液中芳樟醇的终质量浓度为MIC和2 MIC，以等体积50%甲醇溶液为空白对照。在28 ℃、160 r/min的摇床中培养6 h后，6 000 r/min、4 ℃离心10 min收集菌体。以5 mmh5 mm的铝片作承载物，将菌体置于质量分数2.5%的戊二醛溶液中固定4 h，再用无菌PBS洗涤3 次，随后依次以体积分数30%、50%、70%、90%乙醇溶液和无水乙醇进行梯度洗脱，每级静置15 min，将试样室温放置12 h使其完全干燥后喷金观察细胞形态。

1.3.3.4 电导率的测定

取活化两次培养至对数生长期的莓实假单胞菌液，8 000 r/min离心10 min，收集菌体，用PBS洗涤3 次后制得重悬菌液（107CFU/mL），分别加入终质量浓度为MIC和2 MIC的芳樟醇溶液，以等体积50%甲醇为空白对照。于摇床中培养6 h，每小时取样测电导率。

1.3.3.5 细胞膜通透性测定

参考文献[21]通过FDA染色实验研究芳樟醇对莓实假单胞菌MS 02细胞膜通透性的影响。将活化两次培养至对数生长期的菌液6 000 r/min、4 ℃离心15 min，收集菌体并重悬于PBS中，调整菌悬液浓度为107CFU/mL，再分别加入终质量浓度为MIC和2 MIC的芳樟醇，以等体积50%甲醇为空白对照。摇床培养12 h，取各组菌悬液于6 000 r/min、4 ℃离心10 min收集菌体，用PBS洗涤2 次后收集菌体，加入250 μL FDA-丙酮溶液（2 mg/mL）。常温下放置20 min后用PBS洗涤3 次，8 000 r/min、4 ℃离心10 min，收集菌体并重悬于PBS中，用荧光分光光度计在激发波长为297 nm、发射波长为527 nm条件下测定样品的FDA荧光强度，以表征细胞膜通透性。

1.3.3.6 细胞膜完整性测定

按1.3.3.5节的方法制备重悬液（107CFU/mL）并分别加入终质量浓度为MIC和2 MIC的芳樟醇，以等体积50%甲醇为空白对照，分别在28 ℃、160 r/min摇床中培养6 h，每3 h取1 mL的菌悬液，以6 000 r/min，4 ℃离心10 min，上清液过0.22 μm滤膜过滤。取200 μL滤液于96 孔板中，使用酶标仪于260 nm波长处测定其光密度值OD260 nm，每次实验3 个平行。

1.3.3.7 胞内酶活力测定

将活化两次培养至对数生长期的菌液以6 000 r/min、4 ℃离心15 min，收集菌体并重悬于PBS中，调整菌悬液浓度为107CFU/mL，再分别加入终质量浓度为MIC和2 MIC的芳樟醇，以等体积50%甲醇为空白对照。摇床中培养6 h，离心收集菌体，加入PBS重悬，冰水浴超声破碎菌体，每次超声时间为5 s，间隔10 s，重复4 次。参照AKP试剂盒说明书方法，测定AKP活力。参照超微量ATP酶试剂盒说明书测定钠钾ATP酶活力。

1.4 数据处理与统计分析

实验设置3 个平行，实验结果用平均值±标准差表示。采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，采用Tukey检验进行显著性分析，P＜0.05表示差异显著。采用Origin 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 α多样性分析结果

对单样本的α多样性分析可以反映样本内的微生物群落的丰富度和多样性。由表1可知，5 个样品的微生物覆盖率（Coverage）均为1.000，说明该测序结果鉴定了三文鱼片中绝大多数细菌的系统类别。检测结果表明，从0～12 d的样品观察到的细菌OTUs数量分别为121、104、125、135、128。以Shannon、Simpson、Chao1及Ace指数对样品的菌群丰富度和多样性进行初步评估。Shannon指数及Simpson指数用于估算样品中微生物的多样性，Shannon越大，群落多样性越高，Simpson指数则相反；而Chao1指数及Ace指数常用于估算样品的菌群丰度，是OTUs丰度的其他估计量[22]。表中数据显示Shannon指数逐日增加，而Simpson指数则相反，说明样品的微生物多样性逐渐增多；而Chao1及ACE指数均高于每个相应样本的OTUs观察数则表明在所有样品中可能还存在一些额外的微生物门类。

表1 不同贮藏时间三文鱼微生物群落的α多样性指数Table 1 α-diversity index of bacterial community in salmon at different storage periods

基于OTUs分析制作三文鱼样品的Venn图，不同的椭圆代表不同组样品，重叠部分的数字代表样本间共有的OTUs个数，单独的数字代表样本特有OTUs个数[23]。由图1可知，整个贮藏期间三文鱼OTUs总数为210 个，其中5 组样品共有的有56 个，占总数的26.67%；第0天（S0d）OTUs数量为121 个，占总数的57.62%；第3天（S3d）OTUs数量为104 个，占总数的49.52%；第6天（S6d）OTUs数量为125 个，占总数的59.52%；第9天（S9d）OTUs数量为135 个，占总数的64.29%；第12天（S9d）OTUs数量为128 个，占总数的60.95%。第0天特有的OTUs数量为10 个，占总数的4.76%；第3天特有的OTUs数量为4 个，占总数的1.90%；第6天特有的OTUs数量为10 个，占4.76%；第9天特有的OTUs数量为11 个，占总数的5.24%；第12天特有的OTUs数量为12 个，占总数的5.71%。图中各椭圆均与其他组椭圆有重叠的部分，表明各组样品的细菌物种之间互有交叉，图1证明了在贮藏期间的三文鱼细菌群落是动态变化的。

图1 三文鱼样品细菌群落Venn图Fig. 1 Venn diagram of bacterial community in salmon sample

2.2 细菌相对丰度分析结果

分别从门、纲、目、科、属、种6 个水平对三文鱼4 ℃贮藏期间的细菌群落相对丰度进行分析，结果如图2所示。贮藏期间三文鱼的细菌优势菌门为变形菌门（Proteobacteria）；优势菌纲为γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）；优势菌目为弧菌目（Vibrionales）和假单胞菌目（Pseudomonadales）。在科水平的优势菌为弧菌科（Vibrionaceae）、假单胞菌科（Pseudomonadaceae）、伯克氏菌科（Burkholderiaceae）和莫拉菌科（Moraxellaceae）。

三文鱼4 ℃贮藏期间属水平的优势菌为发光杆菌属（Photobacterium）、假单胞菌属（Pseudomonas）、青枯菌属（Ralstonia）和不动杆菌属（Acinetobacter），相对丰度为97%，其中贮藏前期发光杆菌属的细菌在整个菌相系统中处于优势地位，相对丰度为84.89%；而随着时间的延长，假单胞菌属、青枯菌属、不动杆菌属的细菌相对丰度均呈现上升的趋势，其中假单胞菌属的细菌相对丰度上升趋势最为明显，在贮藏初期相对丰度为3.98%，到第12天时相对丰度高达31.46%，并且仍有上升的趋势。此外菌相系统中还存在一些如紫色杆菌属（Janthinobacterium）、希瓦氏菌属（Shewanella）等细菌。而在整个贮藏期间Pseudomonas fragi增长速度最快，在第0、3、6、9、12天相对丰度分别为3.01%、4.89%、11.20%、21.99%、24.82%。

图2 三文鱼细菌群落不同分类水平的相对丰度Fig. 2 Relative abundance of bacterial community in salmon at different taxonomic levels

2.3 优势腐败菌的分离鉴定结果

将1.3.2节分离、纯化后得到菌株进行DNA提取和PCR扩增，测定扩增产物的基因序列并与NCBI数据库中已知的微生物基因序列进行BLAST比对分析，构建系统发育树，选择与已知的微生物基因序列同源性最高且活性最强（活化培养至对数生长期时菌体浓度最高）的菌株，将其命名为MS 02。如图3所示，16S rRNA分析结果证明MS 02为莓实假单胞菌。后续实验均以莓实假单胞菌MS 02为靶细菌。

图3 菌株MS 02与其他假单胞菌之间的系统发育树Fig. 3 Phylogenetic tree between MS 02 and other Pseudomonas

2.4 芳樟醇对莓实假单胞菌的抑菌活性

芳樟醇对水产品优势腐败菌——莓实假单胞菌的抑菌活性如表2所示。当芳樟醇质量浓度为1.00 μg/mL时，莓实假单胞菌的OD595 nm为0.268±0.014，与阳性对照组无显著性差异（P＞0.05），但略高于阳性对照组，因此芳樟醇对莓实假单胞菌的MIC为2.00 μg/mL。图4显示了芳樟醇对莓实假单胞菌MS 02生长的影响，在细菌生长过程中，菌悬液中的细菌浓度与OD595 nm呈正相关，因此能够通过莓实假单胞菌OD595 nm表征细菌的生长状况。由图4可知，空白对照组莓实假单胞菌呈指数型增长，说明溶剂中的甲醇对细菌生长无明显影响。加入MIC和2 MIC的芳樟醇后，细菌生长明显受到抑制，MIC组的OD595 nm仅在培养后期有略微增长，可能是因为芳樟醇剂量较低，且培养时其易挥发导致的。

表2 芳樟醇对莓实假单胞菌的抑菌活性Table 2 Antibacterial activity of linalool against P. fragi

图4 芳樟醇对莓实假单胞菌生长的影响Fig. 4 Effect of linalool on the growth curve of P. fragi

2.5 莓实假单胞菌的微观形貌观察结果

采用芳樟醇处理后的莓实假单胞菌的微观形貌如图5所示，未添加芳樟醇的莓实假单胞菌（图5A）的菌体形态呈完整且表面光滑的杆状结构，当添加芳樟醇后，菌体表面随着芳樟醇添加量的增大出现不同程度的破裂，MIC和2 MIC芳樟醇处理的莓实假单胞菌如图5B、C所示，图5B中菌体表面变得粗糙且不完整，细胞膜产生明显的凹陷褶皱，图5C中的菌体形态被严重破坏，细胞膜几乎完全破裂，内容物溶出。上述结果表明芳樟醇能破坏莓实假单胞菌的细胞结构，导致细胞内容物外泄，从而抑制菌的生长。植物精油因具有疏水性更易作用于细菌细胞膜，破坏胞质膜结构，从而抑制细菌生长[24]。

图5 芳樟醇处理后的莓实假单胞菌SEM图Fig. 5 SEM images of P. fragi treated with linalool

2.6 芳樟醇对莓实假单胞菌电导率的影响

图6反映了芳樟醇对莓实假单胞菌MS 02电导率的影响，当细菌细胞膜被抑菌剂损害时，细胞膜的半透性丧失，胞内电解质大量流出，抑制细菌生长[25]。空白对照组菌液电导率变化不明显，这表明体系中的甲醇不会破坏细胞膜的通透性；加入MIC和2 MIC芳樟醇的菌液电导率迅速上升，表明芳樟醇对莓实假单胞菌的细胞膜有明显破坏作用，细胞膜破损、电解质流出导致菌液电导率的上升。

图6 芳樟醇对莓实假单胞菌电导率的影响Fig. 6 Effect of linalool on electrical conductivity of P. fragi

2.7 芳樟醇对莓实假单胞菌细胞膜通透性的影响

FDA是一种自身无荧光且不带电荷的脂质性分子，在胞内可被酶水解为荧光素发出荧光，当细胞膜受到破坏，荧光素流失从而导致FDA荧光强度降低。因此，细菌细胞膜的通透性可通过FDA荧光强度来反映[26]。图7中显示的是相同处理时间不同处理条件的FDA荧光强度，50%甲醇处理的荧光强度为1 920 AU，MIC和2 MIC组的荧光强度分别为530、211 AU，可以看出添加芳樟醇的处理组其荧光强度明显低于对照组，这表明50%甲醇不能改变细菌细胞膜的通透性。但随着芳樟醇质量浓度增加，细菌细胞膜被破坏程度逐渐明显，2 MIC处理组的荧光强度最低，这表明2 MIC芳樟醇处理能明显破坏莓实假单胞菌的细胞膜，这与图5中2 MIC组菌体形态被严重破坏，细胞膜几乎完全破裂的结论一致。舒慧珍等[26]在探究柠檬烯对荧光假单胞菌细胞膜通透性的影响时也得到了类似的结论。

图7 芳樟醇对莓实假单胞菌FDA荧光强度的影响Fig. 7 Effect of linalool on fluorescence intensity of P. fragi

2.7 芳樟醇对莓实假单胞菌细胞膜完整性的影响

细胞膜的完整性是菌体正常生长代谢的重要影响因素，其受到破坏会导致膜内的DNA和RNA等物质泄漏，DNA和RNA在260 nm波长处具有强吸收作用，故可用菌悬液在OD260 nm的变化反映细菌细胞膜的完整性[27]。如图8所示，在反应3 h后，含芳樟醇组菌悬液中的OD260 nm迅速升高，而空白对照组变化不明显，这与上文的结论相一致，说明PCL不会引起细菌细胞膜的破裂。MIC和2 MIC的芳樟醇会使莓实假单胞菌细胞膜在短时间内破裂，内容物迅速流失，对细菌细胞有较明显的破坏作用。张赟彬等[27]发现肉桂醛会使大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细胞膜完整性被破坏，内容物迅速释放导致菌液在260 nm波长处的光密度值增大，本实验结果与其一致。

图8 芳樟醇对莓实假单胞菌细胞膜完整性的影响Fig. 8 Effect of linalool on cell membrane integrity of P. fragi

2.8 芳樟醇对莓实假单胞菌胞内酶的影响

钠钾ATP酶是一种蛋白酶，存在于组织细胞及细胞器膜上，能维持跨膜离子浓度梯度，测定胞内钠钾ATP酶的活力变化可以分析抑菌剂对细菌细胞能量代谢的影响[28]。由图9可知，在培养6 h后，空白对照组的钠钾ATP酶活力最大，而MIC和2 MIC芳樟醇组的钠钾ATP酶活力都相对较小，且明显可以看出芳樟醇添加量与胞内钠钾ATP酶活力有直接联系。这表明芳樟醇能有效抑制莓实假单胞菌细胞内钠钾ATP酶的活力，影响细胞的正常能量代谢。胡文杰等[29]研究表明油樟叶精油的几种馏分单体也能使尖孢镰刀菌内ATP酶活力下降。

图9 芳樟醇对莓实假单胞菌胞内酶活力的影响Fig. 9 Effect of linalool on intracellular enzyme activities of P. fragi

AKP存在于细胞壁和细胞膜之间，一般难以在胞外被检测到，但当细胞结构被破坏后，AKP会泄漏至细胞外。因此，可通过检测细菌胞外的AKP活力变化来观察其对细胞壁的破坏情况[30]。由图9可知，在培养6 h后，空白对照组AKP活力最高，说明50%甲醇对莓实假单胞菌的细胞壁结构无影响。但添加MIC和2 MIC芳樟醇后，莓实假单胞菌AKP活力降低，这表明芳樟醇的加入会使莓实假单胞菌的细胞壁被破坏，导致菌体电解质外泄，最终抑制菌体生长，且随着芳樟醇添加量的增加，AKP活力降低越明显。

3 结 论

本实验采用HTS分析4 ℃贮藏期间三文鱼的菌相结构，并分离提取出1 株三文鱼优势腐败菌——莓实假单胞菌MS 02，再深入探究芳樟醇对莓实假单胞菌MS 02的抑菌机理。4 ℃贮藏三文鱼的微生物群落多样性与演替规律会随着时间延长而变化。三文鱼的优势菌属为发光杆菌属、假单胞菌属、青枯菌属和不动杆菌属。贮藏期间三文鱼菌相发生极大地变化，各菌群之间相互竞争，假单胞菌属的相对丰度随着时间的延长逐渐增大，莓实假单胞菌是样品在贮藏期间的增长速率最快的菌种。芳樟醇对莓实假单胞菌MS 02具有良好的抑菌效果，SEM结果表明芳樟醇能使细菌细胞膜产生凹陷褶皱，而电导率、OD260 nm、FDA荧光强度和AKP、钠钾ATP酶活力结果则证明了芳樟醇能破坏莓实假单胞菌的细胞膜和细胞壁的通透性和完整性，影响细菌细胞正常能量代谢，导致菌体死亡。