低酯果胶-咖啡酸交联物的构成机理及与抗氧化活性的构效关系

高 凡，艾连中，吴 艳，赖凤羲,*，张 汇，谢 凡，宋子波

（1.上海理工大学健康科学与工程学院，上海食品微生物工程技术研究中心，上海 200093；2.上海交通大学农业与生物学院，上海 200240；3.云南猫哆哩集团食品有限责任公司，云南 玉溪 653100）

天然果胶是植物细胞壁的多糖，商业果胶主要来源于柑橘皮和苹果皮，可作为胶凝剂，稳定剂和乳化剂等在食品中广泛应用[1]。果胶的结构主要由光滑区的半乳糖醛酸聚糖（homogalacturonan，HG）、毛发区的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖第I型（rhamnogalacturonan type I，RG-I）和第II型（RG-II）3 个结构域组成[2-3]，其中HG区的半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）的羧基会部分甲氧基酯化（—COOCH3），因此可分为高酯（酯化度（degree of esterification，DE）＞50%）和低酯（DE＜50%）果胶。高酯果胶在pH 2.8～3.6且蔗糖质量分数大于55%时会凝胶；低酯果胶在pH 3.0～7.0下添加二价阳离子（如Ca2＋）会凝胶[1,4-5]。

果胶为优良的亲水性胶体与膳食纤维，但抗氧化活性低且疏水性不足，限制了其在多功能食品体系（如乳化、微胶囊化或活性纤维）的应用。为了赋予果胶新的功能性（如抗氧化性）以提高其应用范畴和使用价值，结构修饰是常用的策略，包括化学法和生物法，其中生物法成本较高，但绿色安全、可回收永续、逐渐为主流。以酶促酚酸接枝于果胶分子为改良果胶功能性的新技术。

漆酶催化阿魏酸交联于果胶具有以下几项优点：可强化果胶的凝胶强度并加快凝胶化速率，尤其是对于含有内源性阿魏酸的甜菜果胶，容易酶促凝胶[6]；可增强果胶的抗氧化活性[7]；可提高苹果、柑橘和甜菜果胶的疏水性、乳化性和水包油乳液乳化稳定性[8]；果胶不会降解、可保留原有的凝胶和增稠特性。此外，漆酶催化的反应环保且无毒，不需要任何化学引发剂（如H2O2）[9-10]。目前仅对果胶-阿魏酸交联物的特性得到较为清晰的研究结果，鲜见果胶-咖啡酸（caffeic acid，CaA）交联物相关的研究。CaA与阿魏酸同属于羟基肉桂酸类，都是膳食中富含的天然酚酸，具有良好的自由基清除活性、抗癌活性及免疫调节等作用[11]，极具商业应用价值。目前酶促果胶-酚酸（尤其是CaA）交联物的特性、键结的分子机理和交联物的特性（如抗氧化活性）与结构的关系等均尚未被厘清，亟待深入研究。

因此，本研究旨在开发果胶交联物并解析其构成机理，采用漆酶催化果胶-CaA交联物生成，分析交联物的关键组成、光谱图特征及抗氧化活性，并以核磁共振图谱鉴定分子间的键结模式，归纳出影响抗氧化活性的结构因素，以期为新型果胶的应用提供重要理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柑橘低酯果胶 美国CP Kelco公司；2,2’-联氨-双-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS）、漆酶（酶活力0.99 U/mg）、重水（D2O，99.9%）、L-鼠李糖（L-rhamnose，L-Rha）、D-阿拉伯糖（D-arabinose，D-Ara）、D-半乳糖（D-galactose，D-Gal）、D-葡萄糖（D-glucose，D-Glc）、D-GalA等单糖标准品 美国Sigma-Aldrich公司；无水乙醇和氢氧化钠上海泰坦科技股份有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、抗坏血酸、CaA、没食子酸、福林-酚试剂、无水碳酸钠、牛血清白蛋白、酚酞指示剂、硫酸亚铁、肌醇等 上海源叶生物科技有限公司；溴化钾（光谱级）和三氟乙酸 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硝酸钠、盐酸和过氧化氢国药集团化学试剂有限公司；醋酸钠 赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.2 仪器与设备

1260高效分子筛色谱仪-多角度激光光散射 美国Wyatt Technology公司；傅里叶变换红外光谱仪、DionexTMICS-5000＋离子交换色谱系统 美国Thermo Fisher Scientific公司；L5S型紫外-可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司；CR-400色差仪 日本Konica公司；扫描电子显微镜 日本Hitachi公司；AVANCE NEO 700MHz核磁共振波谱仪 德国Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 柑橘果胶的纯化

果胶的纯化参考醇沉法[12]。取果胶粉末以料液比1∶50加入去离子水，搅拌溶解，55 ℃旋蒸浓缩至原体积1/3～1/2后，加入3 倍体积的无水乙醇，于4 ℃冰箱过夜醇沉10 h，离心（7 000 r/min、15 min）后得到下层胶状沉淀，搅拌细碎化，用体积分数70%乙醇溶液和无水乙醇脱水，冷冻干燥即得纯化果胶CLP。

1.3.2 柑橘果胶的改性

果胶改性参考Karaki等[13]的方法并略有改动，取5 g CLP溶于425 mL的磷酸盐缓冲溶液（50 mmol/L、pH 6.5）中，在80 ℃下水浴磁力搅拌1 h，将2 g CaA溶解于75 mL无水乙醇中，将上述两种溶液在30 ℃下混合后（果胶终质量浓度1 g/100 mL，CaA终浓度30 mmol/L），添加漆酶50 U反应4 h，包裹锡箔纸在4 ℃冰箱中暗反应24 h，去离子水透析（8～14 kDa）24 h，每隔6～8 h换一次水，以除去未交联的CaA，旋蒸浓缩后冷冻干燥得到果胶CaA交联物（CLP-CaA），将其放入干燥器中备用。

1.3.3 化学成分组成的测定

果胶DE采用化学滴定法[4]测定。蛋白质量浓度采用考马斯亮蓝法[14]测定，标准品为牛血清白蛋白，标准曲线方程为Y＝5.720 4X＋0.052 8（R2＝0.999，线性方程的质量浓度范围10～70 mg/mL）。总酚含量采用福林-酚法[15]测定，标准品为没食子酸，结果表示为每克干质量样品所含的没食子酸质量（单位为mg/g），标准曲线方程为Y＝0.035 4X－0.011 8（R2＝0.998，线性方程的质量浓度范围0～20 μg/mL）。溶解度的测定是将果胶溶解在超纯水中配制成0.01 g/mL的溶液，常温下以400 r/min过夜搅拌，静置稳定30 min后，在25 ℃下以4 200 r/min离心20 min后，将上清液和沉淀物分别冻干48 h后，称质量并按式（1）计算。

式中：m1是上清液冻干后的质量/g；m2是上清液和沉淀物的总质量。

1.3.4 单糖组成的测定

将10 mg样品在110 ℃下用2 mL 4 mol/L三氟乙酸溶液水解2 h，取出冷却至室温后，用氮吹仪吹干，反复3 次加入甲醇并吹干，最后加入2 mL的超纯水溶解水解物，稀释15 倍，经0.22 μm微孔膜过滤后，进行高效阴离子交换色谱分析。

采用ICS-5000＋高效阴离子交换色谱串联脉冲安培检测器分析样品的单糖组成，色谱柱为串联保护管柱（3 mmh30 mm）的CarboPacTMPA20（3 mmh150 mm）。进样量为25 μL；洗脱液：流动相A为超纯水，B为25 mmol/L NaOH溶液，C为1 mol/L CH3COONa溶液，D为200 mmol/L NaOH溶液。洗脱条件：0 min时80% A＋20% B；20 min时80% A＋20% B；20.1 min时75% A＋20% B＋5% C；30 min时60% A＋20% B＋20% C；30.1 min时100% D；40 min时100% D；45 min时80% A＋20% B；60 min时80% A＋20% B，在40 ℃下采用线性梯度混合模式以流速0.5 mL/min洗脱。采用Chromeleon 7软件进行数据采集、处理和分析。以11种单糖标准品为对照，即岩藻糖（fucose，Fuc）、Rha、Ara、Gal、Glc、木糖（xylose，Xyl）、甘露糖（mannos，Man）、果糖（fructose，Fru）、核糖（ribose，Rib），GalA和葡萄糖醛酸（glucuronic acid，GlcA），通过洗脱尖峰和标准曲线进行样品单糖组成的定性和定量分析，用肌醇作内标，平行测定3 次。参照标准曲线计算出单糖质量浓度和摩尔百分比，标准曲线方程为D-Ara：Y＝1.865 3X＋0.728 0（R2＝0.993，线性方程的质量浓度范围0.25～12.50 μg/mL）；D-GalA：Y＝1.026 7X＋0.041 0（R2＝0.998，线性方程的质量浓度范围0.25～12.50 μg/mL）；D-Gal：Y＝1.993 8X＋0.731 5（R2＝0.994，线性方程的质量浓度范围0.25～10.00 μg/mL）；D-Glc：Y＝2.035 8X＋0.673 9（R2＝0.991，线性方程的质量浓度范围0.25～10.00 μg/mL）；L-Rha：Y＝0.791 0X＋0.231 7（R2＝0.995，线性方程的质量浓度范围0.25～12.50 μg/mL）。其中Y为尖峰面积/（10－9Cgmin）、X为单糖质量浓度/（μg/mL）。

1.3.5 分子质量相关参数的测定

用流动相（0.1 mol/L NaNO3、质量分数0.02% NaN3）制备1 mg/mL的CLP和CLP-CaA样品溶液，过滤后（0.22 μm）取100 μL注入高效分子筛色谱系统分析，该系统配备多角度激光光散射检测器、黏度检测器、示差折射检测器和紫外检测器，串联一支保护管柱和两支分析管柱（OHpak SB-805 HQ（8.0 mmh300 mm，13 μm）和SB-803 HQ（8 mmh300 mm，10 μm）），在40 ℃下以流速0.6 mL/min洗脱80 min；折射率增量设置为0.145 mL/g，并采用ASTRA 7.1.3软件进行数据采集、处理和分析。

果胶大分子的构象通过Mark-Houwink-Sakurada方程[16]（式（2））和非均向性构性参数ρ=Rg/Rh[17]来表征，ρ与分子链构象的刚性和硬度成正比，指数ρ＜0.775、1.5＜ρ＜1.8和ρ＞2分别表示构象为紧密的球状、柔软的无规则线状和伸展性分子，其中环动半径（gyration of radius，Rg）和水合动态半径（hydrodynamic radius，Rh）分别通过Flory-Fox（式（3））和Einstein-Simha公式[18]（式（4））计算得出。

式中：[η]为特性黏度/（mL/g）；M为果胶的摩尔质量/（g/mol）；K和a为与聚合物构象有关的参数（K/（mL/g）），指数a＞1.4、0.8＜a＜1.4、0.5＜a＜0.8、0.2＜a＜0.5和a＝0.0时，分子构象分别为超刚性棒状、刚性棒状、半柔性线圈、无规则线圈和球状球体或高度支链；Φ为Flory-Fox黏度常数，与链的刚性有关；NA为阿伏伽德罗常数（6.02h1023mol－1）。

1.3.6 紫外全波长扫描

分别配制质量浓度0.000 25 g/mL交联前后的果胶溶液，以CaA标准品0.000 01 g/mL作为参比对照，使用L5S型紫外-可见分光光度计在190～600 nm范围内进行全波长扫描，定性分析交联前后果胶最大吸收波长的变化。

1.3.7 色差的测定

采用CR-400色差仪对果胶色差值进行测定。将CLP和CLP-CaA配制为0.005 g/mL的溶液，测定其色差参数L*、a*、b*值和ΔE（CLP与CLP-CaA间的色差），其中ΔE的计算如公式（5）所示。校正白板的L*＝95.2，a*＝－0.44，b*＝3.47。

式中：ΔL*、Δa*和Δb*分别为CLP-CaA与CLP间a*、b*和L*的差值。

1.3.8 傅里叶变换红外光谱扫描

采用KBr压片法，分别将2 mg冻干果胶粉和CaA粉末与100 mg KBr置于玛瑙研钵中研磨压片制成直径7 mm的薄片，使用傅里叶变换红外光谱仪对其进行测试，以空气作为背景，扫描范围为4 000～400 cm－1；扫描次数为64 次；分辨率为16 s－1，使用OMNIC软件进行数据采集和分析。

1.3.9 核磁共振分析

将果胶放置真空干燥箱80 ℃干燥6 h后，称取40 mg的CLP和CLP-CaA溶解于1 mL D2O，反复冻干溶解3 次，将H完全替换为D，转移到核磁管中。以配备BBO超低温探头的AVANCE NEO 700 MHz核磁共振波谱仪在298.0 K下扫描700 MHz1H核磁共振和176 MHz13C核磁共振图谱，谱宽分别为14 706 Hz和41 667 Hz，扫描次数分别为16 384 次和32 768 次，以四甲基硅烷外标物的信号标定化学位移（δ）。氢谱采用去偶合程序去除水（HOD：重水信号峰）在δH4.7～4.8的信号，以提高图谱分辨率。

1.3.10 扫描电子显微镜观察

配制100 μg/mL的样品溶液，在4 ℃下稳定12 h后，所有溶液立即浸入液氮中以快速冷冻。然后，将冷冻的果胶冻干48 h，直到完全干燥。取干燥后的果胶粉末放置于云母盘上，喷金使样品导电，在高真空下以1 kV的电压加速，使用扫描电子显微镜在300 倍和10 000 倍下观察样品表面结构特性。

1.3.11 DPPH自由基清除率测定

参照Kirigaya等[19]的方法稍作修改。将2.0 mL新鲜配制的DPPH溶液分别与2.0 mL不同质量浓度的果胶及其交联物溶液（0.5～3.0 mg/mL）充分混匀，室温避光反应30 min后，以体积分数80%的乙醇溶液调零，在517 nm波长处测定吸光度，以VC为阳性对照（0.005～3.000 mg/mL），按照公式（6）计算DPPH自由基清除率。

式中：A0为空白对照（体积分数80%乙醇溶液代替样品或VC）的吸光度；A1为DPPH溶液与样品或阳性对照VC的吸光度；A2为体积分数80%乙醇溶液代替DPPH溶液的吸光度。

1.3.12 超氧阴离子自由基清除率测定

参照Fridovich等[20]的实验方法稍作修改。将1.0 mL样品溶液（0.5～3.0 mg/mL）、1.0 mL氯化硝基四氮唑蓝（108 μmol/L）和1.0 mL烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（468 μmol/L）溶液均匀混合后加入1.0 mL吩嗪硫酸甲酯（60 μmol/L）溶液，将上述混合好的溶液室温下静置5 min，在560 nm波长处测定吸光度，以上溶液均用Tris-HCl缓冲液（16 mmol/L、pH 8.0）配制，以VC为阳性对照（0.08～3.00 mg/mL），按照公式（7）计算O2－·清除率。

式中：A0为空白对照（Tris-HCl缓冲液代替样品或VC）的吸光度；A1为显色体系（除样品之外的反应体系）与样品或阳性对照VC的吸光度；A2为缓冲液与样品或VC的吸光度。

1.3.13 ABTS阳离子自由基清除率测定

参照Re等[21]的方法稍作修改。用去离子水配制ABTS终浓度为7 mmol/L和过硫酸钾终浓度为2.45 mmol/L的混合溶液，避光置于室温下16 h，即得到ABTS母液。ABTS母液在使用之前用去离子水稀释60～80 倍至其在734 nm波长处的吸光度（A0）为0.90±0.02，即得到ABTS工作液。取0.2 mL样品溶液（0.5～3.0 mg/mL）加入到4 mL ABTS工作液中，在室温避光条件下反应20 min后，于734 nm波长处测定吸光度，以无水乙醇为空白对照，VC为阳性对照（0.01～3.00 mg/mL），按照公式（8）计算ABTS阳离子自由基清除率。

式中：A0为空白对照（无水乙醇代替样品或VC）的吸光度；A1为ABTS工作液与样品或阳性对照VC的吸光度；A2为乙醇代替ABTS工作液的吸光度。

1.3.14 羟自由基清除率测定

参照Smirnoff等[22]的方法稍作修改。将0.6 mL 6 mmol/L FeSO4g7H2O溶液与2.0 mL果胶及其交联物溶液（0.5～3.0 mg/mL）分别混匀后，加入0.6 mL 6 mmol/L的H2O2溶液，充分混匀后反应10 min，再向各管加入6 mmol/L水杨酸-无水乙醇溶液0.6 mL，将各管中的溶液充分混合后反应10 min，在510 nm波长处测定吸光度，以VC为阳性对照（0.06～3.00 mg/mL），按公式（9）计算·OH清除率。

式中：A0为空白对照（蒸馏水代替样品或VC）的吸光度；A1为显色体系（除样品之外的反应体系）与样品或阳性对照VC的吸光度；A2为蒸馏水代替H2O2溶液的吸光度。

1.3.15 Fe2＋螯合率测定

参照Dinis等[23]的方法稍作修改。将1 mL不同质量浓度（0.5～3.0 mg/mL）的果胶及其交联物溶液和2 mmol/L FeCl2溶液0.1 mL、5 mmol/L啡啰嗪-钠盐溶液0.2 mL混合，用3.7 mL蒸馏水补至5 mL混匀。将上述混合好的溶液在室温条件下进行孵育10 min，在560 nm波长处测定吸光度。以EDTA-2Na为阳性对照（0.01～3.00 mg/mL），按公式（10）计算Fe2＋螯合率。

式中：A0为空白对照（蒸馏水代替样品或EDTA-2Na）的吸光度；A1为样品与显色体系（除样品之外的反应体系）的吸光度。

1.4 数据处理与分析

实验结果皆以平均值±标准差表示。显著性差异分析用SPSS Statistics 24.0软件通过Duncan法进行多重比较确定，并以P＜0.05表示具有显著性差异。利用SPSS软件的Probit回归分析计算清除自由基50%对应的样品质量浓度（half maximal inhibitory，IC50）。以OriginPro 2021b软件绘图。

2 结果与分析

2.1 CLP-CaA、CLP的化学组成与水溶解度

图1为果胶及其交联物和单糖混标的离子色谱图，和标准品比较发现，低酯柑橘果胶CLP的GalA含量最多，其次为Gal，然后为Rha和Glc，Ara微量，具备典型的果胶单糖组成特征。与CLP比较，CLP-CaA的GalA尖峰信号强度明显降低，Gal、Rha、Glc和Ara信号强度明显增加。

图1 CLP-CaA、CLP和11种混合单糖标准品的离子色谱Fig. 1 HPAEC chromatograms of CLP, CLP-CaA and a mixture of 11 monosaccharide standards

如表1所示，CLP的DE为38.33%，总酚含量为1.20 mg/g，蛋白质量百分比为2.36%，溶解度为86.95%。与CLP比较，交联物CLP-CaA DE显著上升到46.93%；总酚含量也显著提高到9.64 mg/g；蛋白质量百分比显著提升至4.12%；溶解度显著降低到81.19%。单糖组成方面，CLP的GalA摩尔百分比（GalA%）为51.99%，Gal摩尔百分比（Gal%）为30.95%，Rha摩尔百分比（Rha%）为7.44%，Glc摩尔百分比（Glc%）为9.02%，Ara摩尔百分比（Ara%）为0.60%。与CLP比较，交联物CLP-CaA的GalA摩尔百分比显著降低到44.63%，Gal摩尔百分比显著上升到35.51%，Rha（8.46%）、Glc（10.04%）和Ara（1.36%）摩尔百分比也显著高于CLP。此外还评估了5 种结构指标：同型半乳糖醛酸聚糖摩尔百分比（HG%）、第一型鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I摩尔百分比（RG-I%）、GalA%/（Rha%＋Ara%＋Gal%）、Rha%/GalA%和（Ara%＋Gal%）/Rha%，后三者分别代表果胶的线性比值（果胶链的线性结构，用于评估果胶的线性结构的完整性）、分枝度和RG-I分支侧链的长度。与CLP比较，HG%显著降低、RG-I%显著上升，GalA%/（Rha%＋Ara%＋Gal%）显著降低，Rha%/GalA%和（Ara%＋Gal%）/Rha%无显著变化。综上，CLP结构具有大量的HG（44.55%）和RG-I（46.43%）区域，RG-I的中性糖侧链主要为聚半乳糖，由于无Xyl和Fuc等单糖存在，故CLP中无木糖半乳糖醛酸聚糖，且无第二型的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖II（RG-II）；Glc的存在可归因于黏附在果胶侧链上的半纤维素[24-25]。

表1 CLP-CaA和CLP的化学组成与水溶解度Table 1 Chemical compositions and water solubilities of CLP-CaA and CLP

综上所述，CLP的DE与低酯苹果果胶（DE 41%）[25]和低酯向日葵果胶（DE 34%）[26]相近，低于欧李果胶（DE 52%）[25]和高酯柑橘果胶（DE 55%～56%）[27-28]。此外，CLP的HG%、RG-I%、线性比值和分枝度均接近高酯柑橘果胶（HG% 46%～50%、RG-I% 42%～44%、线性比值1.37～1.78、分枝度0.12～0.15）[27-28]，明显不同于苹果、欧李果和向日葵果胶的结构特征（HG% 59%～70%、RG-I% 24%～106%、线性比值0.7～3.5、分枝度0.04～0.16）[25-26]。因此可推知CLP富含RG-I分子片段且中性糖分枝（由Ara和Xyl组成）含量低是柑橘果胶的共同特征，并受酸液提取条件部分影响。CLP-CaA交联物的DE和总酚含量均显著上升，溶解度和GalA摩尔百分比均显著降低，提高了果胶侧链相对占比。本研究以CLP制得的CLP-CaA总酚含量（9.64 mg /g）低于超低酯柑橘果胶-阿魏酸交联物总酚含量（54.7 mg/g）[13]以及阿拉伯胶-阿魏酸交联物总酚含量（86.2 mg/g）[29]，接近偶联反应制备的壳聚糖-CaA交联物CaA含量（7.67～10.21 mg/g）[30]，故知CLP-CaA的总酚含量是合理的。

2.2 CLP-CaA、CLP的分子质量及构象表征

CLP及CLP-CaA的分子质量参数如表2所示，CLP的重均分子质量（mw）为226.1 kDa，数均分子质量（mn）为86.4 kDa，多分散性指数（polymer dispersity index，PDI）（PDI＝mw/mn）为2.62、固有黏度[η]平均为222.5 mL/g、MHS参数K为0.436 mL/g、a为0.552；而假设果胶分子在0.1 mol/L硝酸钠溶液中为球状，将上述mw和[η]代入Flory-Fox和Einstein-Simha公式，所得Rg为38.9 nm、Rh为16.35 nm、ρ为2.38。CLP的mw和Rg介于高酯柑橘果胶之间（mw174～282 kDa，Rg33～49 nm）[27-28]。交联CaA后，CLP-CaA的mw、mn和K均显著增加（分别为271.4 kDa、114.1 kDa和0.479 mL/g），但PDI、[η]、a、Rg以及ρ均明显降低，分别降至2.38、183.2 mL/g、0.524、30.6 nm以及1.88。综上所述，CaA交联促使CLP果胶的分子质量增加、分布更均一，但分子质量并未增加至使CLP产生双聚合；在0.1 mol/L的硝酸钠溶液中CLP和CLP-CaA皆呈柔软的无规则线圈状（由两者a为0.5～0.8和CLP-CaA的ρ为1.88判知），但CLP的环动体积显著增大、链段较硬（由ρ＞2判知）。

表2 CLP及CLP-CaA交联物的分子质量、固有黏度和分子粒径参数Table 2 Molecular masses, intrinsic viscosities and molecular size parameters of CLP and CLP-CaA conjugate

2.3 CLP-CaA、CLP的紫外-可见吸收光谱和色差

从图2A可见，CLP在190～450 nm范围内无明显吸收峰。CaA有两个吸收峰区域：200～250 nm和260～330 nm，其中218、243、299 nm和326 nm为最大吸收波长。CLP-CaA交联物仅在288 nm波长处发现吸收峰。和CLP相比，CLP-CaA呈现出与CaA相关的特征性吸收峰（288 nm波长处吸收峰和225 nm波长处肩峰），表明CaA的存在。此外，CaA与自由羧基有关的299 nm波长处吸收峰在CLP-CaA中蓝移到288 nm，此蓝移现象也发现于壳聚糖-CaA系统[9,31-32]，与羧基酯化有关。图2B显示CLP溶液的L*、a*和b*值分别为38.04、2.91和17.22，与CLP相比，CLP-CaA的L*值显著降低，表明其亮度下降；a*值显著降低，表明其颜色更偏绿；b*值显著升高，表明其颜色变黄；综合得出与CLP相比（对照组），CLP-CaA的ΔE显著提高（10.40），偏向暗黄色。本研究发现漆酶催化合成CLP-CaA交联物的紫外光-可见光光谱图与色差的变化类似于壳聚糖-CaA[32-33]。

图2 CLP-CaA和CLP的紫外-可见光吸收光谱与CIE色差Fig. 2 UV-visible spectra and CIE color parameters of CLP-CaA and CLP

CLP-CaA交联物呈黄色，与柑橘果胶-阿魏酸交联物[13]以及白萝卜果胶-阿魏酸交联物[34]的黄色一致，不同于利用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/1-羟基苯并三唑（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride/1-hydroxybenzotriazole，EDC/HOBt）偶联反应合成的壳聚糖-CaA交联物呈暗黄色[33]及以酪氨酸酶催化合成的壳聚糖-CaA交联物呈褐色[35]。综上可知，多糖-酚酸交联物呈黄色或褐色，随酚酸和多糖种类不同而异，颜色变化可归因于漆酶催化酚酸与多糖的交联反应，通过漆酶催化，酚羟基两阶段氧化分别生成酚氧自由基和醌类物质，其中醌作用在果胶分子[13,29]上聚合而呈现褐色。

2.4 CLP-CaA、CLP的傅里叶变换红外光谱分析结果

图3A为交联前后果胶和CaA的傅里叶变换红外光谱图，样品在3 423 cm－1处附近的宽峰为OüH的伸缩振动所引起，为糖类的特征吸收峰；在2 935 cm－1处吸收峰为多糖中CüH键的伸缩振动所引起；1 735 cm－1和1 616 cm－1处的吸收峰分别对应于甲酯化和游离羧基中的C＝O键的拉伸振动；1 400～1 200 cm－1处为CüH伸缩振动和变角振动吸收峰；在1 200～800 cm－1之间的光谱被认为是碳水化合物的“指纹”区域[36]，其中1 145 cm－1处为糖苷键上OüCüO不对称的拉伸振动吸收峰，1 100 cm－1与1 017 cm－1处吸收峰与糖环和侧链上的CüCüO拉伸振动有关，为GalA的特征信号，而953 cm－1处小肩峰和835 cm－1处吸收峰分别为β-和α-糖苷键C−O弯曲振动的特征信号[24]。CaA在3 431、2 983、1 648、1 618、1 530、1 278 cm－1处的吸收峰（图3B）分别与芳香环的OüH、CüH、C＝O、C＝O、C＝C和CüO的拉伸振动相关，在803 cm－1和852 cm－1处的两个小而尖锐的峰与CaA苯环上相邻的两个氢原子有关。和CLP相比，CLP-CaA在1 613 cm－1处的峰面积明显减小，出现新的1 519 cm－1特征吸收峰（为CaA独有的特征吸收峰，CLP没有），此结果与CLP-CaA的DE显著高于CLP（表1）和紫外-可见吸收光谱的特征峰蓝移现象（图2A）都证明CLP-CaA的羧基发生酯化，与柑橘果胶-阿魏酸[13]和白萝卜果胶-阿魏酸[34]的研究结果类似，且柑橘果胶-阿魏酸交联物的特征峰在1 515 cm－1（阿魏酸）和1 650 cm－1（自由羧基）处发生变化，表明该酚酸交联键结到果胶的羧基上[37]。

图3 CLP-CaA, CLP和CaA的傅里叶变换红外光谱图Fig. 3 FTIR spectra of CLP-CaA, CLP and CaA

2.5 CLP-CaA、CLP的核磁共振结构特征

由上文可知CLP主要由HG主干和RG-I分枝区所组成，RG-I的中性糖侧链为聚半乳糖（表1）；HG由α-(1,4)-GalA组成，RG-I的聚半乳糖由β-(1,4)-Gal组成，Rha为分枝点[2-3]。参考百香果皮果胶[36]、柔毛橘凤榴果胶[38]以及猴面包树果浆果胶[39]的核磁共振图谱特征，可鉴定出CLP的主要结构单元对应的化学位移信号（δ），如图4A所示，其中氢谱皆为CüH相关的信号。α-D-GalA糖基C1δC99.10和H1δH5.25；C2δC68.02，H2δH3.66；C3δC68.63，H3δH4.02；C4δC77.92，H4δH4.05；C5δC71.07，H5δH4.90；C6羧基δC174.92，无δH；甲氧基C7δC52.82，H7δH3.73。β-D-Gal糖基C1’δC104.32，H1’δH4.48；C2’δC71.77，H2’δH3.51；C3’δC73.26，H3’δH3.6；C4’δC77.62，H4’δH4.26；C5’δC74.47，H5’δH3.6；C6’δC60.69，H6’δH3.89。H5、H1’和H4’信号因接近水HOD信号（δH4.6～4.7）而受去偶合程序去除水信号的影响减小。α-L-Rha糖基C6（以R6表示）δC16.50和H6δH1.11特征明显，伴随δC97.47（C1）和δC70.05（C3）小尖峰。δH3.2～3.7部分尖峰来自甲基酯化的α-D-GalA（图4A中2e、3e）。

图4B为CLP-CaA交联物的核磁共振图谱与鉴定结果。根据几丁聚糖-CaA交联物[32]、羧甲基普鲁兰多糖-阿魏酸交联物[40]和阿拉伯胶-阿魏酸交联物[41]，可知CaA的特征信号区在δC112～168和δH6.3～12.2，反应前CaA C9δC167.7明显不同于CLP糖基的特征区（δC60～110和δH3～6）。氢谱上δH6～8为CaA苯环上次甲基和亚甲基的特征尖峰区，δH6.3、6.75、6.88、7.25和7.51分别来自H8”、H6”、H5”、H2”和H7”。CaA的碳共振信号（δC112～168）受到CLP的化学遮蔽而未显示出。图4B清楚呈现了未交联的糖基信号（同图4A的CLP）及因交联而位移的新共振尖峰（标有*），位移最大的是α-D-GalA糖苷键碳C1*（δC上移到92.12较高磁场遮蔽区）和C4*（δC下移到81.31较低磁场遮蔽区），伴随原来C1（δC99.10）和C4（δC77.92）共振尖峰明显变小，氢谱H1*δH下移到5.34，H4*δH下移到4.11，且H1（δH5.25）和H4（δH4.05）的尖峰明显变小。其他的碳氢和β-D-Gal糖基碳氢的新尖峰位移小，仅在原尖峰附近。

图4 CLP和CLP-CaA的核磁共振图谱与相关结构示意图Fig. 4 NMR spectra and structural illustration of CLP and CLP-CaA

综合上述核磁共振特征变化，可推知漆酶催化CaA作用在CLP的α-D-GalA糖基上，由分子质量的增加程度（表2）说明两者为1分子CaA对1分子自由羧基结合，交联物没有再聚合。此外，α-D-GalA的C6δc由174.92偏移到175.12，此结果和CLP-CaA DE增加（表1）、288 nm波长处有吸收尖峰（图2A）和傅里叶变换红外光谱（图3A）皆支持了CaA作用在α-D-GalA C6羧基上形成酯基的推论，此机制与漆酶催化阿魏酸（和CaA同属于羟基酚酸类）作用于柑橘果胶[13]、羧甲基普鲁兰多糖[40]和阿拉伯胶[41]的羧基上形成酯基的机理类似，涉及半醌中间产物的生成和亲核性作用于GalA C6上，但本研究CLP-CaA没有再聚合形成双聚体，而阿魏酸-普鲁兰多糖交联物涉及生成双聚体[40]。

2.6 CLP-CaA、CLP的微观形态观察结果

图5为CLP及交联物CLP-CaA的扫描电子显微镜图。在放大300 倍下，样品均呈空间网状结构，CLP的结构较为粗糙和疏松，而CLP-CaA表面较为光滑和紧凑。放大10 000 倍下可更清楚地看出两者的网状结构皆呈现细丝交联缠绕推叠，但CLP的网格结构比较杂糅疏松，由无规则卷曲的细丝夹杂着棒状、薄片状、团块状等结构组成；而CLP-CaA多呈柔性细丝状结构缠绕，结构较致密。综上所述，CaA交联可促使CLP-CaA材料表面较细致和均匀光滑，可能是酚酸酯化作用赋予果胶分子链部分疏水性所致。阿魏酸交联于柑橘果胶[7]及CaA交联于壳聚糖[33]也有类似的结构细致化效果。

图5 CLP-CaA和CLP的扫描电子显微镜图Fig. 5 Scanning electron micrographs of CLP-CaA and CLP

2.7 CLP-CaA、CLP的抗氧化活性

图6显示CLP和CLP-CaA对DPPH自由基、ABTS阳离子自由基、·OH、O2－·清除率以及Fe2＋螯合率都有明显的浓度依赖性，且CLP-CaA的效果总体显著高于CLP。在1 mg/mL下，VC、CLP和CLP-CaA的DPPH自由基清除率分别为95.1%、13.4%和55.3%（图6A）；ABTS阳离子自由基清除率分别为100%、2.0%和27.8%（图6B）；·OH清除率分别为100%、37.8%和54.7%（图6C）；O2－·清除率分别为92.2%、6.6%和67.9%（图6D）；而Fe2＋螯合率分别为99.0%、3.6%和11.5%（图6E）。

图6 CLP和CLP-CaA的体外抗氧化活性Fig. 6 In vitro antioxidant activity of CLP and CLP-CaA

上述抗氧化活性的IC50见表3。CLP只有对·OH清除率的IC50为2.02 mg/mL；而CLP-CaA对DPPH自由基、ABTS阳离子自由基、·OH和O2－·清除率的IC50分别为0.82、2.47、0.92 mg/mL和0.72 mg/mL，虽然弱于VC的清除效果（IC50分别为0.01、0.05、0.11 mg/mL和0.32 mg/mL），但对O2－·的清除效果约达到VC的一半，具有潜在的商业利用价值。

表3 CLP和CLP-CaA对不同自由基清除能力的IC50或螯合能力的IC50Table 3 IC50 of CLP and CLP-CaA for scavenging of free radicals and chelating of Fe2＋

本研究发现CaA交联作用可使CLP-CaA抗氧化活性明显提升，尤其是在DPPH自由基、·OH和O2－·的清除方面。比较不同的多糖-酚酸交联物的体外抗氧化活性发现，CLP-CaA的抗氧化活性显著高于果胶-阿魏酸交联物（对DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除率IC50分别为1.4 mg/mL和11.2 mg/mL）[7]，与壳聚糖-阿魏酸交联物（对·OH和O2－·清除率IC50分别为0.75 mg/mL和0.76 mg/mL）[31]无明显差异，但显著低于壳聚糖-CaA交联物（对DPPH自由基、ABTS阳离子自由基、·OH和O2－·清除率IC50分别为0.37、0.17、0.50 mg/mL和0.30 mg/mL）[31-32]。综上可知，CaA交联物比阿魏酸交联物的抗氧化活性高，可归因于CaA的苯环结构中对位和邻位的羟基对自由基具有协同的共振稳定效果，优于具有单一对位羟基阿魏酸的效果。本研究也发现CLP的体外抗氧化活性仅体现在对·OH的清除方面（IC50＝2.0 mg/mL），对其他自由基的清除率效果相对较差，此外，研究表明柑橘果胶（对DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除率IC50分别为29.5 mg/mL和116.2 mg/mL）[7]和阿拉伯胶（对ABTS阳离子自由基清除率IC50为562.28 mg/mL）[29]的抗氧化活性也不明显，说明多糖结构对体外抗氧化活性的贡献相当有限。

3 结 论

本研究主要分析了CLP和CLP-CaA的组成结构差异、色差和表面微观形态，并重点探究了交联机理及其与抗氧化性的构效关系。结果显示CLP和CLP-CaA的DE分别为38.33%和46.93%，总酚含量分别为1.20 mg/g和9.64 mg/g。单糖组成分析结果表明CLP-CaA主要由HG和RG-I组成，其GalA摩尔百分比显著降低、侧链含量增多、分子质量明显增加、构象偏软以及紫外光谱和红外光谱分别在288 nm和1 519 cm－1出峰都证明了CLP-CaA中含有CaA单元。核磁共振波谱发现相较于CLP，CLP-CaA在δH6～8出现CaA质子峰，且接枝反应主要在α-D-GalA糖基的C6羧基上。此外，交联物的微观结构趋于紧密和光滑，更偏柔性且颜色变黄。此外，交联果胶的抗氧化性也得到了显著性提升，归因于果胶链上接枝CaA含有酚羟基，故CLP-CaA可作为新型果胶抗氧化剂。后续研究可以探索果胶交联物的抗菌性、免疫活性以及在多种应用条件（如pH值、温度和盐离子）下的流变特性变化，以优化应用的配方。