常见大豆制品中蛋白质的体外消化特性

阳 倩，冯广鑫，冯炜婷，李彦磊，杨晓泉

（华南理工大学食品科学与工程学院，食物蛋白与胶体研究中心，广东省天然产物绿色加工与产品安全重点实验室，广东 广州 510640）

植物蛋白作为饮食中蛋白质来源之一，因其健康、清洁及环境友好而受到全世界广泛关注[1-5]。然而，与动物蛋白质相比，植物蛋白消化率低，必需氨基酸组成不完整，目前还不可作为人类唯一营养源[6-7]。由于植物白蛋白结构致密，具有大量的二硫键和自结合能力，故存在一定的抗消化性[8]。此外，一些常见植物蛋白缺乏某些必需氨基酸，且含有酶抑制剂、皂苷和单宁等抗营养因子[9]，限制了其生物利用率。因此，为了改善植物源蛋白的营养特性，可以通过结合来自互补植物源的蛋白质来满足必需氨基酸的需求；也可以通过增加摄入量来弥补其较低的蛋白质消化率[6]。然而，这些都需要对植物蛋白的消化过程有更多的了解。

体外模拟消化的方法被广泛应用于食物的胃肠道行为研究[10-13]。尽管体内（人类或动物中）研究仍被认为是解决饮食相关问题的“黄金标准”，但体外模拟消化的方法具有速度更快、成本更低、劳动强度更低、没有伦理限制的优势[14]。因此，需要建立能模拟人体消化过程中发生生理过程的体外消化模型，以替代体内实验。这些模型要考虑相关的消化条件，主要包括消化酶的种类和浓度、胃和肠阶段的pH值、消化时间和盐浓度等[12]。但由于不同文献中体外消化模型在参数的设置上存在显著差异，阻碍了不同研究比较结果和推断普遍结果的可能性。静态体外消化模型（INFOGEST）组织的主要目的之一是固定模拟消化食物的条件，并尽可能统一消化模型，建立共识协议。该共识协议于2014年首次发布[14]，最近又进行了更新——INFOGEST 2.0[15]。INFOGEST组织旨在对静态消化方法的流程和参数进行标准化统一，固定膳食与消化液的比例以及固定每一消化阶段的pH值。食物样品经口腔消化、胃消化和肠消化3 个阶段。其中，模拟消化液、酶、胆汁、pH值和消化时间等参数是基于现有的生理数据。该方法可用于分析消化产物（如多肽/氨基酸、脂肪酸、单糖）和评估食物基质中微量营养素的释放，评估食物消化的终点。虽然体外模型不能完全体现出体内消化的复杂性，但其已被证明能有效替代动物和人体模型，并已作为筛选工具来解决与饮食相关的问题，例如蛋白质消化、生物利用度、生物活性化合物的释放和食物的结构变化等[12,16-17]。

大豆起源于中国，在亚洲已有近5 000 年的种植史[18]。大豆是高品质蛋白质的丰富来源，含有人类需要的大部分氨基酸，不含胆固醇，饱和脂肪较少[19]。作为重要的经济作物，大豆经常出现在人们的餐桌上。数据显示，2019年全年世界大豆消费总量为3.519亿 t，我国消费量达1.082亿 t，占世界大豆总产量的30.75%，同时我国的大豆的需求量也跃居世界首位[20]。然而，食品基质中的大豆蛋白的消化性还不清楚。因此，本研究基于INFOGEST 2.0[15]评估常见大豆制品中蛋白质的体外消化特性。具体来说，本实验对不同大豆制品的结构（液体与固体）、加热程度（微波、水煮、无热处理）和食物基与蛋白基（天然食品制备与分离蛋白）进行比较。本研究分析常见的6种大豆制品üü豆腐（氯化钙豆腐、氯化镁豆腐）、豆浆、微波大豆、水煮大豆、大豆分离蛋白（soybean protein isolate，SPI），其中豆浆和钙、镁豆腐基本成分相同，但结构不同；微波大豆和水煮大豆是由同样的大豆经过不同的热处理而得，选用SPI为参考对照。本研究通过对不同大豆制品水解产物的分析探究其蛋白质的消化性差异，以更好地了解在INFOGEST 2.0和不同烹饪方式的作用下大豆蛋白的水解与消化特性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆产地为辽宁省沈阳市；低温脱脂豆粕由山东禹王实业有限公司提供。

α-唾液淀粉酶（100 U/mg）、胃蛋白酶（3 000 U/mg）、胰液素（6 U/mg） 美国Sigma-Aldrich公司；牛胆盐上海麦克林生化科技有限公司；凝固剂MgCl2和CaCl2（食品级） 连云港日丰钙镁有限公司；其他试剂均为分析纯；所有实验用水均为去离子水。

1.2 仪器与设备

PB80Easy218破壁机 中国美的公司；ZEN3600纳米粒度仪 上海思百吉仪器系统有限公司；Synergy Neo2多功能酶标仪 美国伯腾公司；M00665预制胶金斯瑞生物科技有限公司；1290超高压液相色谱-高分辨质谱联用仪 美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 原料制备

SPI：将脱脂豆粕与去离子水按照料液比1∶10（m/V）混合，用2 mol/L NaOH调节pH值至8.0并在室温下300 r/min搅拌2 h，接着8 000 r/min离心20 min得到上清液，用1 mol/L HCl调整滤液pH值至4.5。随后将滤液在6 000 r/min、4 ℃下离心15 min，弃去上清液，所得沉淀即为SPI；将沉淀取出，以料液比1∶10（m/V）加去离子水复溶，在持续搅拌下调整pH值至7.5，待完全溶解后装入透析袋，在去离子水中于4 ℃下透析48 h，冷冻干燥，留样备用。

豆浆的制备参考文献[21]：浸泡：将清洗后的大豆与去离子水以质量比1∶6于常温下充分浸泡12 h，膨胀至原大豆体积2.2 倍左右；破壁：将沥干后的湿大豆与去离子水以1∶4的质量比混合，用破壁机在6档下破壁5 min，然后用纱布过滤；煮制：把滤浆倒入不锈钢锅中置于电磁炉上加热，煮制过程中不断搅拌以防糊底，并将浮沫撇去，维持锅内浆液（94±2）℃，5 min后即得豆浆。

豆腐的制备参考文献[22]：取豆浆制备方法中破壁处理5 min后的滤浆，待浆液温度降至85 ℃，立即以质量比25∶1加入0.03 mol/L MgCl2溶液或CaCl2溶液，迅速搅拌均匀，静置30 min得到豆花；压制成型：将静置后的豆花倒入豆腐模具内，物料上方放置铁块使多余的浆水流出以便成型，压制4 h后即可得镁豆腐或钙豆腐。

水煮大豆：浸泡步骤同豆浆的制作。沥干后在沸水中煮制25 min，捞出擦干表面水分后备用。

微波大豆：60 g大豆洗净后沥干放入微波专用盘中，再放入微波炉中加热。模式设为高火，加热2 min后取出，翻面，再放入微波炉中继续加热2 min。

在模拟消化前，固体大豆制品（镁豆腐、钙豆腐、水煮大豆、微波大豆）已用小型粉碎机磨碎至颗粒粒径约3 mm，模拟口腔食糜粒径。SPI没有做任何的热处理，用去离子水配成质量分数为4%（与豆奶蛋白质量分数相近）的溶液作为待消化的样品。所有样品制备当天进行体外模拟消化。

1.3.2 体外模拟消化

采用INFOGEST 2.0[15]进行6种大豆制品的静态体外消化模拟，并稍作修改。配制模拟唾液、胃液、肠液储备液，模拟消化时加入酶、胆盐、CaCl2溶液、去离子水等，储备液分别稀释1.25 倍得到模拟唾液、模拟胃液、模拟肠液（表1）。

表1 模拟消化液（唾液、胃液、肠液）成分Table 1 Compositions of simulated digestion fluids (saliva, gastric fluid, intestinal fluid)

5 g的样品在5 mL的模拟唾液（含75 U/mL唾液淀粉酶）中消化2 min。再加入10 mL模拟胃液（含2 000 U/mL胃蛋白酶）并用5 mol/L HCl溶液调节pH值为3.0，消化0、30、60、120 min。最后加入20 mL模拟肠液（含10 mmol/L牛胆盐和100 U/mL胰液素），用1 mol/L NaOH调节pH值至7.0，消化0、30、60、120 min。

消化前，所有的储备液和去离子水等试剂均已预热至37 ℃，酶液现用现配，并置于冰中保存，在样品与储备液混合后再添加。所有的体外消化实验均在50 mL圆底离心管中进行，水平放置于恒温摇床中（37 ℃、100 r/min）。每个时间点采用单独管进行消化。1 mol/L NaOH溶液调节pH值至7.0以终止胃消化；100 ℃水浴煮制5 min以终止肠消化。以等质量去离子水代替食物作为胃、肠空白组。结束消化后，所有样品立即置于液氮中冷冻10 min。解冻后所有的胃、肠消化液在4 ℃、6 000 r/min条件下离心15 min，收集上清液于－20 ℃保存备用，剩余沉淀部分冻干并用于后续电泳分析。

1.3.3 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

在还原条件下，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）对消化上清液和沉淀的水解物进行鉴定。SDS-PAGE可以对完整蛋白和分子质量大于5 kDa的蛋白片段进行鉴定和半定量。样品制备：取1.3.2节消化后备用的上清液和沉淀，40 µL上清液或0.02 g溶于40 µL去离子水的沉淀与10 µL的上样缓冲液混匀，在100 ℃煮沸5 min。制样完毕后，在12%预制胶中加入20 µL/孔样品，凝胶电泳于恒压模式下进行，开始时电压保持在80 V，进入分离胶后增至120 V。在含50%（体积分数）甲醇、10%（体积分数）冰醋酸的1 g/L考马斯亮蓝R-250溶液中染色45 min，然后于洗脱液（含50%（体积分数）甲醇、10%（体积分数）冰醋酸）中脱色过夜（约12 h）。

1.3.4 液相色谱-质谱联用测定分子质量

采用液相色谱-质谱联用（liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS）分析体外模拟消化模型下6种大豆制品肠消化液随时间变化的水解作用。这种技术可鉴定分子质量较小的肽（分子质量小于3 kDa）。将胃肠消化上清液用超纯水稀释至所需的蛋白质量浓度（50 µg/mL）备用。色谱分析条件：A液为0.1%（体积分数）甲酸水溶液；B液为0.1%（体积分数）甲酸-乙腈水溶液（乙腈体积分数为84%）。质谱分析条件：电喷雾离子源，毛细管温度为180 ℃，载气流速4.0 L/min，电喷雾电压3.5 kV，扫描范围50～3 000 Da，扫描速率26 000 Da/s。筛选质荷比大于50，相对丰度大于0.2%的数据进行分析鉴定。

1.3.5 游离氨基浓度的测定

参照Church等[23]的方法，使用邻苯二甲醛（orthophthalaldehyde，OPA）方法测定消化上清液中的游离氨基浓度，以表征总蛋白的水解程度进行定量。OPA在1,4-二巯基苏糖醇的存在下与游离氨基形成黄色化合物，其在340 nm波长处有特征吸收，用分光光度计测定其340 nm波长处吸光度。游离氨基浓度根据10 mmol/L磷酸盐缓冲液配制不同浓度（0～10 mmol/L）的L-亮氨酸标准溶液得到的标准曲线确定，结果用L-亮氨酸当量表示，单位为mmol/L。

1.3.6 粒径分布测定

胃肠消化液的粒径分布由纳米粒度分析仪测定，测定范围为0.4～8 630.0 nm。样品加入测定池中，平衡120 s后进行测定。以水为溶剂，折射率为1.333。每个样品测试3 次，采用Zetasizer软件分析不同粒径的体积分数。

1.4 数据处理与分析

所有实验得到的数据用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析检验，采用邓肯检验进行显著性分析，显著性水平为P＜0.05。每个样品平行测定3 次，所有实验重复两次。采用Origin 2019b软件作图。

2 结果与分析

2.1 体外模拟消化后样品的SDS-PAGE结果

体外消化研究是理解影响植物蛋白水解的重要方法，以期最大程度地优化植物蛋白的营养价值。蛋白质体外消化模型主要以蛋白质的消化率为参数，而蛋白质消化率作为评价食物营养价值的重要指标，是指食物中被消化吸收的蛋白质占总蛋白含量的比例。蛋白质消化率越高，消化后产生的氨基酸含量越多，营养价值越高[24]。蛋白质的可消化性和消化产物性质与其营养价值密切相关。为了考察不同加工方式对大豆蛋白体外消化情况，本研究应用INFOGEST 2.0模拟消化，并对6种大豆蛋白制品的不同消化阶段取样进行SDS-PAGE分析，通过电泳条带变化判断样品的消化水解情况。

大量研究表明，用不同加工方式处理具有相同氨基酸组成的蛋白质，导致蛋白质胃肠道消化物可消化性和营养有效性差异的主要原因是空间结构发生变化[25-27]。Waibel等[28]研究表明，当加热温度过高时，半胱氨酸、胱氨酸会发生脱硫反应，肽键断裂，形成硫化氢、二甲基硫化物、磺基丙氨酸等，造成氨基酸的严重破坏。然而，对于由四级结构组成的蛋白质分子而言，蛋白质亚基是由一条多肽链折叠成的三级结构球蛋白[29]。

研究认为蛋白经过胃蛋白酶的初步水解，产生分子质量较大的多肽[30]，故在SDS-PAGE的胃消化阶段可见大量条带（图1和图2）。未经过加热处理的SPI在胃消化开始时（0 min）显示出19～117 kDa的典型多肽蛋白结构。这是因为其富含疏水性氨基酸，从而形成较为紧密的分子结构，使其对胃蛋白酶作用的抵抗性较强。7S（50 kDa和70 kDa附近）在胃消化阶段表现出对胃蛋白酶有抗性，但未在肠消化中被检测到，11S（20 kDa和30～34 kDa附近）则在胃消化开始后很快消化完全；水煮大豆条带都主要分布在10～35 kDa，条带颜色较深，沉淀中蛋白含量高（图1D），说明经胃蛋白酶后产生大量小分子蛋白，由于蒸煮的温和条件诱导的热变性及较弱的氧化引起蛋白质部分展开，使胃蛋白酶更容易地进入水解位点；与其他底物不同的是，微波大豆在整个胃消化期间都很稳定，条带相比其他样品较少且变化不大，沉淀中可溶性成分少（图1E），说明微波大豆经胃消化后蛋白迅速被酶解，可能是微波自内而外的加热方式破坏了蛋白质的一级结构以及亚基的空间构象，促进蛋白水解。豆浆电泳图中也分布有分子质量19～117 kDa的条带，但相比较于SPI其颜色呈浅色且密集程度更低，由豆浆消化沉淀的电泳图（图2D）可知，胃消化过程中有大量蛋白聚集形成了沉淀，导致豆浆消化液上清液的蛋白浓度较低，这可能是由于高温使蛋白严重变性，引起蛋白质发生热聚集，重新包埋了原本已暴露的酶结合位点。同时变形的蛋白质不易于酶结合，减弱了酶对蛋白质的消化降解作用[31]；钙豆腐与镁豆腐条带分布几乎相同，但相比于钙豆腐，镁豆腐在分子质量40～70 kDa处的条带更明显，90 kDa处条带在胃消化30 min（泳道2）后消失，40 kDa处条带在胃消化120 min（泳道1～4）过程中逐逐渐消失（图2B），由此可知，90 kDa处条带经过胃消化迅速水解，40 kDa处条带逐渐水解。同时，豆腐沉淀的电泳图（图2E、F）中也都显示存在不同程度的蛋白聚集，聚集程度镁豆腐大于钙豆腐，但两者均小于豆浆，说明胃阶段两种豆腐消化程度均大于豆浆，且钙豆腐比镁豆腐更易消化；胃肠消化后，不论是SPI还是经不同加热处理的大豆制品的消化液，电泳图大体上与空白（泳道C）相近，大豆蛋白均被彻底消化为短肽。说明在胃蛋白酶作用下部分消化的蛋白质经胰液素催化后充分水解。

图1 SPI、水煮大豆、微波大豆的体外模拟消化物上清液和沉淀的SDS-PAGE结果Fig. 1 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE) patterns of supernatants and precipitates from in vitro simulated digestion products of SPI, boiled soybean, and microwaved soybean

图2 豆浆、镁豆腐、钙豆腐的体外模拟消化物上清液和沉淀的SDS-PAGE结果Fig. 2 SDS-PAGE patterns of supernatants and precipitates from in vitro simulated digestion products of soybean milk, Mg-tofu and Ca-tofu

2.2 体外模拟消化后样品中的肽分子质量分布

SDS-PAGE从分子质量层面表征了各大豆制品的蛋白水解程度，但肠消化中蛋白被彻底消化，无法进一步比较水解程度，而LC-MS可以检测出低分子质量肽（＜3 kDa）。LC-MS分析不同肠消化时间肽的分子质量，结果如图3所示。样品经胃肠消化后，蛋白质在胃蛋白酶和胰液素的作用下分解成小分子肽段和游离氨基酸，6种底物的肽分子质量中位数均分布在（1.00±0.25）kDa内，即由大约6～8 个氨基酸组成的小分子肽段，处于该分子质量范围的肽片段更容易被吸收[32]。表明在肠消化中蛋白质水解强烈，且经过不同时间的肠消化，所有底物几乎完全消化为小肽，而SDS-PAGE未能识别出这样的小肽。

图3 大豆制品体外模拟消化后的肽分子质量分布Fig. 3 Molecular mass distribution of peptides after simulated digestion of soybean products in vitro

豆浆、钙豆腐消化液中多肽的分子质量中位数随时间的推移趋于稳定，而镁豆腐消化液中多肽的分子质量中位数在60 min后开始下降，120 min时与钙豆腐消化液中多肽的分子质量中位数相近。SPI、水煮大豆、微波大豆消化液中多肽的分子质量中位数大致趋势为SPI＞水煮大豆＞微波大豆，但其随时间变化的规律不明显。

2.3 体外模拟消化后上清液中游离氨基浓度

OPA法被广泛用于测定蛋白质的游离氨基浓度，与SDS-PAGE结合可以更好地表征消化过程中蛋白质水解程度。OPA法可以对胃和肠消化液中的初级游离氨基进行定量，以反映蛋白质的消化程度。游离氨基浓度越高表示蛋白质消化水解的程度越大。一般来说，伯胺基团的数量随着胃和肠道消化的进行而增加。然而，总蛋白消化的速度和程度在不同加热处理的底物中存在差异（图4）。

图4 大豆制品体外模拟胃（A）和肠（B）消化过程中上清液的游离氨基浓度变化Fig. 4 Changes in free amino group concentrations of supernatants from soybean products during in vitro simulated gastric (A) and intestinal (B) digestion

与胃消化初期相比，各处理样品胃消化末期游离氨基浓度显著增加（P＜0.05），且经微波加热的样品的游离氨基浓度明显高于其他处理的样品，SPI游离氨基浓度全程较低，而水煮大豆介于两者之间。在胃消化初期，豆浆、镁豆腐和钙豆腐游离氨基浓度无明显差异，而随着胃消化的开始，豆腐的游离氨基浓度显著增加，且钙豆腐的增加效果更明显，这样的趋势持续到了胃消化结束。由图4A可知，不同热处理条件对大豆蛋白胃消化有促进作用，热处理导致蛋白质变性、结构伸展，进而使包藏于分子内部的活性基团及酶结合位点暴露，增加了对蛋白酶的敏感性和表面疏水性，因此易被胃蛋白酶消化降解，导致水解程度增加[31]。

与胃阶段相比，各处理样品肠消化阶段游离氨基浓度显著增加，说明蛋白质消化主要在肠道中进行，与SDS-PAGE（图1、2）中胃消化后仍有大量蛋白或肽类，而肠消化后除消化酶外无可见条带的结果相印证。小肠是人体的主要营养物质吸收部位，而作为内肽酶的胰蛋白酶可以沿其底物的一级结构在氨基酸链的中间切割肽键，因此胰蛋白酶的加入能大幅度提高大豆蛋白水解度，并产生大量的小分子活性肽[33]。值得注意的是，胃消化中游离氨基浓度不同的两种豆腐在肠消化末期的游离氨基浓度没有明显差异，但均高于豆浆。说明两种豆腐的消化程度相近，且均高于豆浆。不同热处理的底物水解程度在肠消化末期中也有与胃消化末期相近的趋势。

2.4 体外模拟消化后样品的粒径分布

根据Stokes定律[34]，沉降速度与蛋白粒子的半径平方成正比，沉降速度越快即表示粒子越大，反之越小。大豆制品的胃消化液和肠消化液在各时间点的粒度分布分别如图5、6所示。为了更好地比较样品之间的粒径，将消化后的样品粒径分为3 个部分：1～10 nm、10～100 nm和1 000～10 000 nm。

图5 动态光散射测定大豆制品在体外模拟胃消化过程中的粒径分布Fig. 5 Particle size distributions of in vitro gastric digestion products of soybean products at different time points, as determined by laser light scattering

图6 动态光散射测定大豆制品在体外模拟肠消化过程中的粒径分布Fig. 6 Particle size distribution of in vitro intestinal digestion products of soybean products at different time points, as determined by laser light scattering

胃消化后豆浆的粒径大于镁豆腐和钙豆腐的粒径，有明显的双峰分布趋势。根据王丽丽[35]的研究，豆浆粒径分布存在两个峰的原因一方面是加热使豆浆中小分子天然蛋白质溶解度变大；另一方面是较强的热处理促使蛋白发生聚集，形成较大颗粒。镁豆腐与钙豆腐初始粒径相近，但随时间变化先增加后减小，在胃消化末期的粒径小于钙豆腐。相比较于主峰分布于10～100 nm的SPI，水煮大豆和微波大豆的粒径偏大且多峰，这与样品的原始形态有关。

肠消化液的粒径随时间变化基本保持稳定，进入肠消化后，固体食物的食糜粒径较相对应的胃消化阶段显著减小。且多呈单峰分布。镁豆腐和钙豆腐的粒径主要分布在1～10 nm，与胆盐的尺寸相似，说明样品中的蛋白已消化完全。而微波大豆和水煮大豆的粒径分布在范围更大的10～100 nm，且呈多峰分布。而液体样品中，SPI粒径分布从胃阶段的10～100 nm增加至肠阶段的1 000～10 000 nm，豆浆由胃阶段的多峰分布转为集中分布在1 000～10 000 nm。

3 结 论

本研究利用INFOGEST 2.0对常见大豆制品进行体外模拟消化，探讨在标准的静态体外模拟消化模型下不同的加工处理对大豆蛋白的消化影响，在完整的蛋白质、肽、小肽和游离氨基释放水平上评估蛋白质水解情况。结果表明，不同加工方式均能促进大豆蛋白的消化。经过胃消化阶段后，几种大豆制品中部分蛋白被消化。而肠消化后，大豆蛋白均被彻底消化为短肽。相较于SPI，微波加热明显提高了游离氨基浓度，水煮加热则较为温和。两种不同盐离子制成的豆腐在肠消化末期游离氨基浓度和分子质量分布无明显差异，消化程度均大于豆浆。表明不同盐离子（Ca2＋、Mg2＋）制成的豆腐在完全消化后无明显差别。这些样品加热后的变化可能展现出胃肠道消化过程中蛋白质消化的差异。本研究有助于更好地了解在INFOGEST 2.0和不同加工方式的作用下大豆蛋白的水解与消化特性，可为人们膳食植物蛋白提供参考。