基于静电纺丝法包封沙棘油纳米纤维的制备与表征

曹 倩，王齐蕾，王 枭，王艺璇，史 婵，吕新刚

（西北大学食品科学与工程学院，陕西 西安 710069）

沙棘油（sea buckthorn oil，SBO）富含不饱和脂肪酸、类胡萝卜素、生育酚、植物甾醇等生物活性物质，营养价值丰富。因富含亚油酸和亚麻酸这两种人体必需脂肪酸使SBO成为广受欢迎的天然植物油之一[1]，但是SBO不稳定，当暴露于氧气、光、湿和热条件下时，易氧化变质并导致挥发性化合物的损失，造成SBO本身及其加工品的品质降低。

富含不饱和脂肪酸的天然油脂的氧化酸败是油脂在贮藏过程中普遍存在的问题。针对这一问题，通常采用向油脂中添加抗氧化剂（如丁基羟基茴香醚、2,6-二叔丁基对甲酚等）的方法解决。但人工合成抗氧化剂并不符合清洁标签要求，且会给消费者在选择过程中带来一定的困扰。因此，天然抗氧化剂是替代人工合成抗氧化剂的良好选择。

沙棘叶是沙棘种植过程中的一种副产物，通常作为废弃物被处理。但研究证实沙棘叶提取物（sea buckthorn leaf extract，SBE）中含有丰富的多酚和黄酮化合物，显示出很高的抗氧化活性；另外，SBE对金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌和蜡状芽孢杆菌的生长具有强烈的抑制作用[2]，可被开发为天然食品防腐剂[3]。此外，SBE还具有降血糖[4]、提高免疫力[5]、调节脂质代谢[6]和抗炎[7]的作用，可以抗心肌缺血和增强心功能[8]。因此，SBE具有作为天然抗氧化剂的潜力，可添加到SBO中用于提高油脂抗氧化性和稳定性，并赋予SBO更多的生物学功效。

微胶囊包埋法是20世纪70年代兴起的一种利用天然或合成聚合物材料覆盖固体、液体或气体材料并封装在微胶囊中成为固体颗粒产品的包埋技术，近年来在食品工业中得到广泛应用。采用合适的壁材将油脂包裹起来不仅可以提高油脂的稳定性，还可以改变油脂形态并遮蔽其不良风味。将SBO微胶囊化，增加其溶解性和稳定性，对提高其经济附加值十分必要。目前，用于SBO的物理包封方法主要有喷雾干燥[9]和冷冻干燥[10]。

静电纺丝技术是指利用高静压电场作用实现将纺丝液制备为纳米纤维的一项技术[11]，其制备的纳米纤维具有比表面积大、结构可控和生物相容性好等优点，已在药物载体、组织工程支架等方面有较好的应用[12]。García-Moreno等[13]将乳清蛋白分离物与聚乙烯醇混合成乳液，通过静电纺丝技术获得高omega-3脂肪酸包封率（（92.4f2.3）%）的纳米纤维。Karim等[14]将玉米醇溶蛋白（Zein）与肉桂醛制备成乳液，经静电纺丝处理后，能够有效地封装肉桂醛并使其免受环境条件的不利影响。邓姣等[15]以紫胶铵盐为壁材，用静电纺丝法制备了白藜芦醇/紫胶铵盐固体分散体，白藜芦醇的包封率、负载率分别为79.06%、7.91%。玉米醇溶蛋白有较强的疏水性，常用来制备疏水性的药物、食品功能性成分及抗菌成分的输送载体。随着溶剂的蒸发，Zein的自组装特性在在乙醇-水溶液中体现，在此过程中，部分二级结构从α-螺旋转变为β-折叠，随后β-折叠结构会在疏水作用下首尾相连形成条带，之后卷曲成环状，从而逐渐自组装成纳米颗粒。此外，Zein在氢键、二硫键和疏水性相互作用下可以形成薄膜等微结构。因此常被用于脂溶性成分的包封递送[16]。

本实验以Zein为壁材，通过静电纺丝技术制备富含SBO的纳米纤维，并加入SBE，研究SBE及物理包封对SBO稳定性、抗氧化性及体内消化性能的影响，以期为高稳定性及高抗氧化性SBO固态产品的开发提供技术和理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

沙棘叶由内蒙古天骄实业集团有限公司提供，将其风干后用高速粉碎机细化，过4 mm筛孔，得到沙棘叶粉末；沙棘叶粉末利用乙醇回流提取后收集上清液，冷冻干燥得到SBE。

SBO购自北京高原圣果沙棘制品有限公司；Zein（纯度98.1%，分析纯）购自合肥博美生物有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

100D静电纺丝机 长沙纳仪仪器科技有限公司；IRAffinity-1S傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectrometer，FTIR）仪 日本岛津公司；STA 449F3热重分析仪 德国耐驰公司；扫描电子显微镜德国蔡司公司；分光测色仪 深圳市三恩驰科技有限公司；分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 静电纺丝法制备SBO纳米纤维

使用静电纺丝法制备SBO纳米纤维。首先配制聚合物溶液，将Zein溶于体积分数80%乙醇溶液中，磁力搅拌均匀，制备终质量浓度25 g/100 mL的Zein溶液，然后按照表1配制各聚合物溶液，继续搅拌直至混合均匀，在10 ℃下贮藏过夜，以确保各样品完全水合。核层为聚合物溶液，壳层为无水乙醇，将溶液吸入5 mL注射泵中，启动静电纺丝机，以1 mL/h的流速连接内外同轴不锈钢针头（22/17 G），在24 kV的施加电压下进行纺丝，于14 cm收集距离处放置滚筒进行收集，滚筒绕卷速率为250 r/min，收集好的样品放置于装有干燥剂的密封袋中低温贮藏备用。

表1 聚合物溶液配制Table 1 Preparation of polymer solutions

1.3.2 纳米纤维的扫描电子显微镜观察

通过扫描电子显微镜来观察添加SBO和SBE纳米纤维的外观形态。工作电压为5 kV，工作距离为6.5～7.5 mm，在观察之前将样品黏附到导电胶上，并在真空环境下用金溅射。

1.3.3 加速氧化实验

氧化稳定性是评价油脂微胶囊质量的重要参数，参照常明等[17]加速氧化实验方法，考察60 ℃加速氧化条件下游离SBO和被包封SBO纳米纤维的氧化稳定性。将游离的SBO和被包封SBO纳米纤维放置在（60f2）℃恒温干燥箱中，避光保存18 d。在第0、9、18天分别分析纳米纤维的颜色、油脂过氧化值（peroxide value，PV）和总抗氧化性。

1.3.4 体外模拟胃肠消化

功能食品或药物输送体系被人体摄入后主要经过口腔、胃，再经小肠吸收后进入人体的血液循环中。对于理想的功能食品或药物输送体系，应能够在胃部强酸环境下保持相对稳定，而进入肠道环境后能充分释放出功能因子，以提高功能因子生物利用度[18]。参考Ydjedd[19]和Tomas[20]等的方法制备模拟胃液（simulated gastric fluid，SGF）和模拟肠液（simulated intestinal fluid，SIF），然后将300 mg纳米纤维加入至5 mL SGF（包含20 mg胃蛋白酶（25 000 U/mL）和2.5 µL CaCl2g6H2O溶液（0.3 mol/L）），用6 mol/L HCl溶液调节pH值至2，混合物在37 ℃恒温水浴振荡培养2 h，取样1 mL液氮冷冻；然后将混合物加入10 mL SIF（包含37.5 mg胰蛋白酶（800 U/mL）和40 mg胆盐），用1 mol/L NaOH溶液调节pH值至7，37 ℃恒温水浴振荡培养2 h。向模拟消化后的消化液中加入异辛烷以提取消化液中的油相，12 000 r/min离心10 min后吸取上清液，并将其旋转蒸发至恒质量，称质量即为消化液中SBO质量，按式（1）计算消化后SBO的释放率，确定SBO的生物可及性。然后测定消化前后抗氧化活性的变化，评估消化对抗氧化性能的影响。

式中：mA为消化前添加纳米纤维的质量乘以负载量/mg；mB为消化液中提取的SBO质量/mg。

1.3.5 指标的测定

1.3.5.1 包封率和负载量的测定

通过测定纳米纤维中实际包封SBO质量，计算SBO纳米纤维的包封率和负载量，用以评价SBO被包封的效果。准确称取100 mg纳米纤维，将其溶解在6 mL正己烷中，浸泡1 min以去除表面未包封的SBO，然后以12 000 r/min离心10 min，取上清液，用氮吹仪将其吹干至恒质量以去除溶剂，称量前后的质量差计算出游离SBO质量，然后按照公式（2）和公式（3）分别计算包封率和负载量。

式中：mA为纳米纤维中理论SBO质量/mg；mB为上清液中游离SBO质量/mg；mC为纳米纤维的质量/mg。

1.3.5.2 傅里叶变换红外光谱分析

FTIR可以对化合物的结构进行定性分析。参考Salas等[21]的方法，使用FTIR仪测定包封SBO和SBE纳米纤维的红外谱图。扫描范围为4 000～400 cm－1，分辨率为0.4 cm－1。

1.3.5.3 热重分析

热重分析采用STA 449F3热重分析仪，动态氮气气氛，流速为100 mL/min，升温速率为10 ℃/min，从30 ℃加热到900 ℃，结果用热重（thermal gravity，TG）和微分热重（differential thermal gravity，DTG）曲线来表示。TG和DTG曲线分别表征样品质量损失和质量损失速率与温度的关系。

1.3.5.4 色泽的测定

参考郑君花[22]的方法，使用L*a*b*法测定不同贮藏条件下的SBO纳米纤维的色泽。实验开始之前需要进行测色仪的预热和核对校准，以减少仪器误差。测色仪的预热时间设定为15 min，核对的项目为黑白色。取纳米纤维膜样品置于试样盒上，采用反射模式测定并记录数值，每个样品平行测定3 次。

1.3.5.5 油脂过氧化值的测定

根据GB/T 5009.37ü2003《食用植物油卫生标准的分析方法》中的分光光度比色法并参考于夕娟[23]和罗旋[24]等的方法，通过测定PV分析纳米纤维在不同贮藏条件下的氧化稳定性。样品中的过氧化物会将Fe2＋氧化为Fe3＋，Fe3＋可以与硫氰酸盐反应生成橘红色的硫氰酸铁络合物。在510 nm波长处测定吸光度，以Fe3＋标准溶液绘制标准曲线，根据标准曲线方程计算PV，结果以每千克油中的过氧化物当量表示（单位为meq/kg）。准确称取1.0 g纳米纤维样品于试管中，向其中加入2 mL水和2 mL异辛烷，涡旋振荡10 s，共计3 次，然后4 000 r/min离心10 min取上层萃取的有机相，加入一定体积的三氯甲烷-甲醇混合试剂（7∶3，V/V）稀释，接着加入显色剂硫氰酸铵和氯化钡，室温下准确放置5 min后测定其在510 nm波长处的吸光度，以三氯甲烷-甲醇混合溶剂（7∶3，V/V）为参比。

1.3.5.6 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力测定

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力测定参考Ortega-Vidal等[25]的方法，并稍作修改。取1.0 g纳米纤维，加入3.0 mL体积分数80%乙醇溶液，搅拌使其充分溶解，8 000 r/min离心10 min；取1 mL上清液，加入3 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液，混合物在室温黑暗环境中反应30 min后，于517 nm波长处测定吸光度，对照组由1 mL无水乙醇和3 mL DPPH溶液组成。以抗坏血酸（VC）为对照物作标准曲线，样品的DPPH自由基清除能力以每克提取物所含VC质量表示，单位为mg/g。

1.3.5.7 抗氧化能力测定

抗氧化能力（ferric reducing ability of plasma，FRAP）的测定在de Morais等[26]的方法上略作改动。3.6 mL FRAP试剂（300 mmol/L pH 3.6醋酸盐缓冲液、10 mmol/L溶解在40 mmol/L盐酸中的二硫代苏糖醇、20 mmol/L FeCl3g6H2O，以10∶1∶1的体积比配制）中加入400 µL上清液（制备方法同1.3.5.6节），混合物在37 ℃水浴10 min后测定593 nm波长处吸光度。以七水硫酸亚铁作标准曲线，结果以每克提取物所含Fe2＋质量表示，单位为mg/g。

1.4 数据统计与分析

每组实验平行3 次，结果均表示为平均值±标准差，采用SPSS Statistics 20软件通过方差分析（analysis of variance，ANOVA）和Duncan多重比较来确定数据间的显著性水平（P＜0.05表示差异显著）。并用Origin Pro 8软件作图。

2 结果与分析

2.1 SBO纳米纤维扫描电子显微镜观察结果

SBO纳米纤维的扫描电子显微镜如图1所示，整体来看纳米纤维呈电纺纤维状，形态良好、分布均匀，为静电纺丝状态。其中，Zein＋SBO＋SBE（图1C）的纳米纤维纺丝无结节、更加均一。和图1A中的Zein纳米纤维相比，可以发现壁材的浓度越大，越容易形成纤维状的纳米纤维[27]，但是应合理地控制条件，如果溶液浓度过大，则喷射的液体容易不稳定，很难喷出均匀的纤维，而浓度过小则聚合物溶液无法形成射流，将无法获得纤维[28]。总之，纳米纤维外观形态取决于溶液的性质、工艺参数和环境条件，合理控制条件可以生产出形态良好的微球颗粒或纤维薄膜。

图1 负载SBO的纳米纤维扫描电子显微镜图Fig. 1 SEM images of nanofibers loaded with SBO, zein + SBO and zein + SBO + SBE

2.2 SBO纳米纤维FTIR分析结果

从图2可以看出，SBO的FTIR光谱由7 个峰组成，波数范围在2 924～721 cm－1。其中，2 924、2 854 cm－1处吸收峰为油烯烃基上的CüH振动所引起，1 743 cm－1处吸收峰为C＝O双键拉伸振动所引起，1 157、1 097、721 cm－1处为CüO酯键吸收峰[29]。Zein＋SBE和Zein＋SBO＋SBE纳米纤维中，1 652 cm－1附近为酰胺I带的C＝O吸收峰，1 539 cm－1处为酰胺II带的NüH吸收峰。与Zein、Zein＋SBE相比，Zein＋SBO、Zein＋SBO＋SBE均有游离SBO油烯烃基上CüH的吸收峰，且CüO酯键吸收峰略有偏移，说明静电纺丝制备Zein＋SBO＋SBE过程是物理包封。此外，光谱中的峰均没有分裂，说明SBO在纳米纤维中分散均匀、体系良好。综上分析可得，Zein＋SBE对SBO进行了有效的物理包封，形成了稳定的SBO纳米纤维。

图2 负载SBO纳米纤维等的傅里叶变换红外光谱Fig. 2 Fourier transform infrared spectra of SBO nanofibers loaded with SBO

2.3 SBO纳米纤维热重分析结果

通过热重分析可以了解纳米纤维的耐热性。由图3A可知，SBO在389.3～459.0 ℃温度范围内质量最终下降了99.31%，在419 ℃处质量损失速率达到最大，为－13.74%/min。由图3B、C可知，Zein在292.1～362.3 ℃温度范围内质量下降了78.38%，在362.3 ℃处质量损失速率达到最大，为－9.54%/min；Zein＋SBE在283.5～358.1 ℃温度范围内质量下降了76.56%，在323.4 ℃处质量损失速率达到最大，为－8.46%/min；Zein＋SBO在289.8～410.2 ℃温度范围内质量下降了90.46%，在324.8 ℃处质量损失速率达到最大，为－6.79%/min；Zein＋SBO＋SBE在286.5～389.6 ℃温度范围内质量下降了89.01%，在317.5 ℃处质量损失速率达到最大，为－7.2%/min。

图3 SBO纳米纤维的TG曲线和DTG曲线Fig. 3 Thermogravimetric and differential thermogravimetric analysis curves of SBO nanofibers

可以看出，SBO纳米纤维具有高耐热性，在300 ℃左右开始降解。添加SBE的SBO纳米纤维最终保留的质量分数为10.99%，未添加SBE的SBO纳米纤维最终保留的质量分数为9.54%，游离SBO最终保留的质量分数为0.69%并且降解速率的峰值最大（－13.74%/min），可见包封可以提高油的热稳定性。另外，沙棘叶酚类提取物是一种有效的抗氧化剂，可以使物质免受高温而降解。这可能是酚类物质与Zein之间形成的氢键相互作用力使得蛋白质的结构发生变化[30]，从而增强了蛋白质的耐热性能，提高了SBO的热稳定性。

2.4 SBO纳米纤维包封率和负载量

表2列出了Zein＋SBO和Zein＋SBO＋SBE纳米纤维的包封率和负载量，二者接近。许多研究证明，纳米纤维包封率的差异主要取决于封装方法、封装的化合物和所用的涂层材料，另外芯材与壁材的质量比也至关重要[31]。纳米纤维的包封率均大于90%，实际负载量与理论负载量接近。可以看出Zein＋SBO和Zein＋SBO＋SBE均具有较高的包封率和负载量。表明静电纺丝是一种有效的包封技术，可用来包封SBO，也体现出静电纺丝工艺条件的有效可行性。

表2 SBO纳米纤维的包封率和负载量Table 2 Encapsulation efficiency and loading capacity of SBO nanofibers

2.5 加速氧化过程中SBO纳米纤维的变化

2.5.1 SBO纳米纤维色泽变化情况

表3列出了纳米纤维在不同贮藏时间下色泽的变化情况。可以看出添加SBE的SBO纳米纤维颜色偏绿，这是因为SBE本身偏绿色。未添加SBE的SBO纳米纤维在第0天和第9天的色差∆E在2.17～3.02范围内，可以发现，前9 d纳米纤维的颜色变化明显，为较小色差，第18天色差超过3，为较大色差，说明随时间的延长，SBO的颜色发生变化。添加SBE的SBO纳米纤维色差先升后降，在第18天结束时色差小于3，表明添加SBE可以减弱颜色的变化，对SBO颜色具有保护作用。第9天时Zein＋SBO＋SBE组L*值与a*值相比第0天都有较大变化，导致∆E明显增大，但因为颜色来源的多样性和变化的复杂性，具体导致该组样品颜色先升后降的原因还有待于后续深入研究。

表3 SBO纳米纤维在贮藏期间色差的变化Table 3 Changes in color parameters of SBO nanofibers during storage

2.5.2 SBO纳米纤维过氧化值变化情况

图4反映了游离油和包封油在加速氧化过程中PV的变化情况。酸败的变化趋势直接影响PV曲线的走向，PV的增加速率变化越快，油脂酸败的变化速率也将随之变快，表明氧化稳定性逐渐变差。从图4可以看出，随着贮藏时间的延长，SBO的PV呈不断上升趋势，至第18天时PV增加4.1 倍，表明油脂氧化产生的过氧化物含量明显增加；Zein＋SBO组PV缓慢上升，至第18天仅增加0.3 倍；而Zein＋SBO＋SBE组的PV在18 d的贮藏期内没有显著变化，以上结果与高雅馨等[32]的研究结果一致。包封可以减缓SBO氧化速率，提高其稳定性，加入SBE可以进一步提高对SBO的保护作用，即包封与加入抗氧化成分是提高SBO氧化稳定性的有效手段。

图4 SBO纳米纤维在贮存期间PV的变化Fig. 4 Changes in PV of SBO nanofibers during storage

2.5.3 SBO纳米纤维抗氧化活性变化情况

图5A显示了SBO及SBO纳米纤维DPPH自由基清除能力的变化，图5B显示了SBO及SBO纳米纤维FRAP的变化。总的来说，随着贮藏时间的延长，DPPH自由基清除能力和FRAP不断下降，这是由于抗氧化成分在加速氧化贮藏期间的降解，其中游离SBO抗氧化能力最低。另外可以看出，加入SBE的SBO纳米纤维抗氧化能力远高于未加SBE的纳米纤维，这归因于SBE中活性物质本身所具有的抗氧化性。综上，SBE是一种有效的天然抗氧化剂，通过包封并加入SBE可以高效地提高SBO的稳定性和抗氧化性，是一种前景良好的复配技术。

图5 SBO纳米纤维在贮藏期间抗氧化能力的变化Fig. 5 Changes in antioxidant capacity of SBO nanofibers during storage

2.6 模拟消化过程中SBO的释放率和抗氧化活性变化情况

2.6.1 SBO的释放率

任何营养物质只有经历胃肠消化仍被保留才有可能被人体吸收利用。因此，测定消化后纳米纤维中SBO的释放率非常重要。如表4所示，纳米纤维在肠液中的释放率高于在胃液中的释放率，说明纳米纤维在胃肠消化过程中被逐步释放。另外，添加SBE的SBO纳米纤维在胃液和肠液中的释放率均高于未加SBE的纳米纤维，说明SBE有助于提高SBO在肠液中的释放率，这可能是因为SBE的存在增强了SBO对胃肠液中酶、pH值等环境条件的耐受性，从而使SBO更多地被保留并在肠液中释放出来，提高了油的生物可及性。

表4 SBO纳米纤维在消化过程中的释放率Table 4 Release rate of SBO nanofibers during digestion

2.6.2 SBO纳米纤维抗氧化活性变化情况

模拟消化过程中纳米纤维抗氧化活性的变化情况见表5。对于DPPH自由基清除能力而言，游离SBO的DPPH自由基清除能力随着消化过程的进行不断下降，显而易见，消化过程降解了大部分活性成分，使得SBO的抗氧化能力下降。然而，SBO纳米纤维的DPPH自由基清除能力先下降后上升，这种现象可用表4中SBO的释放率来解释，活性物质在胃肠液中缓慢释放，肠液中的释放率大于胃液，使得肠液中的抗氧化能力提高。另外，添加SBE的SBO纳米纤维DPPH自由基清除能力在消化结束后约为游离SBO的24 倍，约为未加SBE的SBO纳米纤维的4 倍。同样的，Neo等[33]将食品级没食子酸添加到Zein静电纺丝纤维后，发现没食子酸仍保留了其抗氧化活性，从而增强了纤维的抗氧化能力。对于FRAP而言，游离SBO同样在消化过程中不断下降，而SBO纳米纤维则先下降后上升，消化结束后添加SBE的SBO纳米纤维的FRAP分别约为游离SBO和未加SBE的SBO纳米纤维的50 倍和8 倍。可见包封与加入抗氧化剂结合的复配不仅保护了活性成分免受胃肠液降解，而且还提高了SBO纳米纤维的抗氧化能力。

表5 消化过程中SBO纳米纤维抗氧化活性的变化Table 5 Changes in antioxidant activity of SBO nanofibers during digestion

3 结 论

本研究将SBE加入到SBO中，并通过静电纺丝方法制备了一种高稳定性和高抗氧化性的SBO纳米纤维，所得纳米纤维形态良好、分布均匀。通过包封以及加入SBE的复配手段，提高了SBO的热稳定性、耐热性和抗氧化能力。通过模拟胃肠消化实验证明包封可使SBO在胃肠内的消化达到缓释效果，且消化后仍保留了活性成分的抗氧化能力。总体而言，SBE的高抗氧化性使其具有成为营养补充剂和功能强化剂的潜力，添加SBE的高稳定性和高抗氧化性SBO纳米纤维具有显著提升的商品属性；同时，静电纺丝是一种能够生产增值生物聚合物微纤维和纳米纤维的技术，该方法温和的加工条件使其在食品加工行业中十分具有潜力。