凉粉草精油微乳液抗氧化和抗A375细胞增殖活性

罗伟斌，曹扬建，吴尔文，赵振刚

（华南理工大学食品科学与工程学院，广东 广州 510640）

凉粉草（Mesona chinensisBenth.）又名仙草、仙人草，为唇形科凉粉草属一年或多年生草本植物，广泛分布于东南亚和我国江西、广东、福建、广西、云南等地[1-2]。我国凉粉草资源丰富、价格低廉，有广阔的产品开发利用前景[2]，凉粉草在日常饮食中被用作黑凉粉的原料，也被用于生产制作凉茶、龟苓膏等食品，凉粉草资源的生产加工附加值较低。凉粉草精油（Mesona chinensisBenth. essential oil，M.EO）作为凉粉草中具有活性的组分之一，其受到的关注较少，现有的一些研究报道集中在其组分的种类及含量分析[3-5]，鲜有关于抗菌活性的报道[6-7]。植物精油为高附加值的产品，因此研究M.EO的生物活性将为凉粉草资源的高值化开发与利用提供新的思路和理论依据。

植物精油是天然的植物次级代谢产物，其除了具有芳香气味外，还具有抗氧化、抗增殖、抗炎、抗菌、抗病毒等活性，因此在食品、日化、医疗保健等领域广受关注[8-9]。但是，植物精油的水溶性差、易挥发，且对温度、光照等条件敏感，在实际应用中受到极大限制。

微乳液是由一定比例的油相、水相、表面活性剂、助表面活性剂所形成的各向同性、热力学稳定体系[10]。微乳液可根据所要包埋的活性物特性来设计其组分和结构，能够极大地拓展植物精油的应用。此外，因其具有粒径小、可自发形成、制备简单、组分易得等优点，被广泛用于食品、医药、日化等行业[11]。

本实验通过水蒸气蒸馏法提取M.EO，并通过气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用仪分析其组成；选择在食品行业广泛应用的材料分别作为表面活性剂和助表面活性剂，在凉粉草精油微乳液（M.EO microemulsion，M.EO-ME）构建前使用伪三元相图来筛选合适的助表面活性剂、表面活性剂、表面活性剂与助表面活性剂质量比（Km）和混合表面活性剂与油相的质量比（Smix）；通过黏度、电导率、亚甲基蓝扩散情况、粒径、多分散指数（polydispersity index，PDI）来表征微乳液的构型变化和理化性质；最后采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）、过氧自由基清除能力（peroxyl radical scavenging capacity，PSC）法以及人恶性黑色素瘤细胞A375细胞模型来比较M.EO和M.EO-ME的抗氧化、抗肿瘤细胞增殖活性，以期为凉粉草资源的高值化开发与利用提供理论依据，为凉粉草精油的商业化应用提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

凉粉草（干制品）购于武平盛达农业发展有限责任公司。

甘油、1,2-丙二醇、无水乙醇 国药集团化学试剂有限公司；吐温20、吐温40、吐温60、吐温80、正己烷上海麦克林生化科技有限公司；抗坏血酸（VC）、DPPH、水溶性维生素E（Trolox）、2,7-二氯二氢荧光素二乙酯（dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）、2,2’-偶氮二异丁基脒二盐酸（2,2’-azobis(2-amidinopropane)-dihydrochloride，ABAP）、荧光素钠 美国Sigma公司；人恶性黑色素瘤细胞A375细胞 美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection，ATCC）；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（75 mmol/L、pH 7.4）、高糖培养基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM） 美国Gibco公司；青霉素-链霉素溶液 上海碧云天生物技术有限公司；胎牛血清 浙江天航生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

水蒸气蒸馏装置 佛山捷特轻工机械有限公司；7890A-5975C型GC-MS、DB-5ms气相色谱毛细管柱（60 mh0.25 mm，0.25 μm） 美国Agilent公司；DDS-11A电导率仪 上海仪电科学仪器股份有限公司；NDJ-8S旋转黏度计 上海昌吉地质仪器有限公司；Zetasizer Nano ZSE纳米粒度仪 英国Malvern公司；DU730分光光度计 美国Beckman Coulter公司；Filter Max F5多功能酶标仪 美国Molecular公司；细胞CO2培养箱美国Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 凉粉草精油的提取

M.EO采用水蒸气蒸馏法提取[12]：将凉粉草粗粉碎至长度约3 cm，取120 kg粉碎后的凉粉草于水蒸气蒸馏装置中，按照料液比1∶10（m/V）加入1 200 kg水，保持微沸状态蒸馏3 h。收集冷凝液上层精油粗提物（约20 L），分多次萃取粗提物，每次取1 L的粗提物用1.5 L的石油醚萃取，重复萃取2 次。收集萃取所得上层液体（有机相），加入无水硫酸钠干燥30 min，过滤后将滤液45 ℃旋转蒸发去除石油醚，得澄清透明的金黄色M.EO，密封于棕色玻璃瓶中，4 ℃避光保存备用。

1.3.2 气相色谱-质谱联用分析凉粉草精油的组分

GC-MS分析前，M.EO需用正己烷按照体积比1∶100稀释。

气相色谱条件：色谱柱：DB-5ms气相色谱毛细管柱（60 mh0.25 mm，0.25 μm）；载气：高纯氦气（99.999%）；进样口温度：250 ℃；柱流速：1 mL/min；进样量0.2 μL；分流比30∶1；升温程序：60 ℃保持3 min；3 ℃/min升温至120 ℃；4 ℃/min升温至180 ℃；15 ℃/min升温至280 ℃，保持15 min。

质谱条件：接口温度：280 ℃；电子轰击离子源，电离能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；质量扫描范围：33～450m/z；检索谱库：Nist08，最后用峰面积归一化法计算各组分的相对含量。

1.3.3 M.EO-ME的制备及伪三元相图的绘制

首先将表面活性剂与助表面活性剂混合形成混合表面活性剂，两者的质量比为Km。以M.EO为油相，制备混合表面活性剂与M.EO质量比（Smix）分别为9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9的混合油相，然后一边搅拌一边在混合油相中逐滴滴加去离子水，记录体系达到临界点（由澄清变浑浊）时加入去离子水的体积，根据已加入的混合表面活性剂和油相的质量绘制伪三元相图，分别以混合表面活性剂、油相、水相作为伪三元相图的3 个顶点，根据油相、水相、混合表面活性剂在临界点的质量分数来确定该点在相图中的位置，记录临界点在伪三元相图上的位置，由临界点围成的区域为微乳区域，通过Originlab绘图软件计算微乳区域相对面积。

1.3.4 M.EO-ME的组成优化和影响因素

1.3.4.1 助表面活性剂的种类对微乳液形成的影响

以吐温80为表面活性剂，分别与无水乙醇、甘油、1,2-丙二醇以Km＝2∶1进行混合，得到混合表面活性剂，并参照1.3.3节的方法绘制伪三元相图，比较各助表面活性剂的微乳区域相对面积。

1.3.4.2 表面活性剂的种类对微乳液形成的影响

以无水乙醇为助表面活性剂，分别与吐温20、吐温40、吐温60、吐温80以Km＝2∶1进行混合，得到混合表面活性剂，并参照1.3.3节的方法绘制伪三元相图，比较各表面活性剂的微乳区域相对面积。

1.3.4.3Km对微乳液形成的影响

以吐温60为表面活性剂，无水乙醇为助表面活性剂，两者以Km分别为1∶2、1∶1、2∶1、3∶1进行混合，得到混合表面活性剂，并参照1.3.3节的方法绘制伪三元相图，比较各Km的微乳区域相对面积。

1.3.5 M.EO-ME的构型分析

黏度和电导率的变化可以简单且直观地反映微乳液的不同构型间的转变，因此被广泛应用于微乳体系的构型表征[13]。此外，通过观察亲水性或亲油性的染液在微乳体系中的扩散情况，同样可以直观地表征微乳液的构型转变[14]。制备水分质量分数分别为0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，以吐温60为表面活性剂，无水乙醇为助表面活性剂，Km＝2∶1和Smix＝8∶2的微乳液。在25 ℃下，测定各体系的电导率和黏度，并在各体系中滴加2 滴水溶性染液亚甲基蓝（1 g/L），观察染液扩散情况，分析微乳液的构型变化。

1.3.6 M.EO-ME的理化性质和稀释稳定性分析

参照1.3.5节方法测定M.EO-ME（Km＝2∶1、Smix＝8∶2、水分质量分数＝70%）的电导率和黏度，然后在25 ℃条件下，用100、200 倍体积的去离子水将M.EO-ME稀释，使用Zetasizer Nano ZSE纳米粒度仪测定其平均粒径和PDI。

1.3.7 M.EO及其微乳液的抗氧化活性测定

参考文献[15]测定M.EO及其微乳液的DPPH自由基清除能力。称取一定量的DPPH粉末溶解于无水乙醇中配制成2 mmol/L的DPPH储备液。DPPH储备溶液在使用前用无水乙醇稀释得到0.2 mmol/L DPPH工作液。取1 mL 0.25、0.5、1.0、2.0、3.0 mg/mL M.EO及微乳液样品（均以精油计）或5、15、20、25 μg/mL VC溶液，与等体积的DPPH工作液混合均匀。于25 ℃避光反应30 min后，在517 nm波长处测定溶液的吸光度。DPPH自由基清除率按照公式（1）计算。以VC为阳性对照，采用Calcusyn软件分别计算VC、M.EO和M.EO-ME的半数效应剂量（median effective concentration，EC50），以VC EC50与样品EC50的比为样品的DPPH值/（μmol/g）。

式中：样品与DPPH工作液的混合液吸光度为As；无水乙醇与样品的混合液吸光度为A0；无水乙醇与DPPH工作液的混合液吸光度为空白对照Ac。

参考文献[16]测定M.EO及其微乳液的ORAC。分别称取Trolox和样品，用PBS配制6.25、12.50、25.00、50.00 μmol/L的Trolox溶液以及不同质量浓度的样品。在避光的环境下，分别在黑色96 孔板中加入20 μL/孔不同剂量的Trolox溶液或样品，并加入200 μL 0.96 μmol/L荧光素钠盐，混合均匀。在37 ℃下孵育20 min后，每孔加入20 μL 119 mmol/L ABAP溶液。将黑色96 孔板放入多功能酶标仪中，设置激发波长和发射波长分别为485 nm和538 nm。在37 ℃下，每5 min测定一次荧光强度，共35 个荧光循环。以Trolox为阳性对照，ORAC由回归方程计算得到，并以Trolox当量表示，单位为μmol/mg。

参考文献[17]测定M.EO及其微乳液的PSC。用PBS稀释得到1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mg/mL的M.EO和0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL的M.EO-ME（以精油计）或1.0、2.4、3.2、4.8、6.3 μg/mL的VC溶液。黑色96 孔板中分别加入100 μL不同质量浓度的样品或VC溶液。预先加入1 mmol/L KOH溶液使DCFH-DA水解5 min，然后向黑色96 孔板的每孔加入100 μL 13.26 μmol/L DCFH-DA和50 μL 200 mmol/L ABAP。将黑色96 孔板放入多功能酶标仪中，设置激发波长和发射波长分别为485 nm和538 nm。在37 ℃下，每5 min测定一次荧光强度，共40 min。以VC为阳性对照，PSC以VC当量表示，单位为μmol/g。

1.3.8 M.EO及其微乳液的细胞毒性和抗增殖活性测定

人恶性黑色素瘤细胞A375的培养基为含有10%（体积分数）的胎牛血清、10 mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和1%（体积分数）青霉素-链霉素溶液的高糖DMEM培养基。细胞在37 ℃、5%（体积分数）CO2细胞培养箱中培养。

参考文献[18]，采用亚甲基蓝测定法评价M.EO及其微乳液的细胞毒性。先用培养基分别稀释得到60、120、180、240、300、360、420、480、540、600 μg/mL M.EO或10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL M.EO-ME（以精油质量计）。按2.5h104个/孔将细胞接种在96 孔板上。在细胞培养箱中孵育24 h后，吸弃培养液，每孔加入100 μL不同质量浓度的样品，设3 个复孔，以加入100 μL不含样品的培养基为对照组，加入100 μL PBS作为空白组，继续孵育24 h，吸弃培养液，每孔用100 μL PBS洗涤细胞，加入50 μL亚甲蓝溶液（6 g/L）对细胞进行染色。于培养箱中孵育1 h后，吸弃亚甲蓝溶液，96 孔板用清水洗净，拍干并向每孔加入100 μL乙醇-PBS-乙酸洗脱液（体积比为50∶48∶1），振荡20 min。将96 孔板放入全波长酶标仪，测定570 nm波长处的吸光度。按照公式（2）计算细胞毒性。

式中：As为样品孔减去空白孔的吸光度；Ac为对照孔减去空白孔的吸光度。

参考文献[19]进行抗增殖活性评价。按1.5h104个/孔将细胞接种在96 孔板上，并在恒温培养箱中孵育4 h。移除培养基后，每孔分别加入100 μL质量浓度60、120、180、240、300、360、420、480、540、600 μg/mL M.EO或质量浓度10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL M.EO-ME（以精油质量计）。以加入100 μL不含样品的培养基作为对照组，加入100 μL PBS作为空白组。孵育48 h后，用前述细胞毒性的方法染色、读板。细胞增殖率按照公式（3）计算。

式中：As为样品孔减去空白孔的吸光度；Ac为对照孔减去空白孔的吸光度。

1.4 数据处理与分析

所有样品均设置3 个平行，处理后的数据以平均值±标准差表示。采用Origin 2020软件作图，Sigmaplot 14.0软件计算曲线下积分面积，采用Calcusyn 2.1软件计算浓度效应，采用SPSS 22.0统计分析软件进行单因素方差分析，采用Duncan检验进行显著性分析，P＜0.05表示存在显著性差异。

2 结果与分析

2.1 M.EO的化学组分

从M.EO分离出42种组分，根据峰面积归一化法计算各组分相对含量，其中相对含量高于1%的组分有17种，占总峰面积的91.58%。由表1可知，M.EO中相对含量较高的组分有香树烯（25.53%）、β-石竹烯（19.31%）、异石竹烯（11.30%）、甲位葎草烯（8.30%）、佛术烯（7.62%），这些组分主要为烯萜类化合物及其氧化物。

表1 M.EO挥发性组分中相对含量高于1%的组分Table 1 Volatile components of M.EO with relative content greater than 1%

有文献报道，M.EO中的主要组分如香树烯、β-石竹烯、异石竹烯和甲位葎草烯等具有较好的抗氧化、抗增殖活性[20-22]，因此可为其后续的活性研究奠定基础。

2.2 M.EO-ME的构建和优化

2.2.1 助表面活性剂对微乳液形成的影响

在微乳液形成过程中，助表面活性剂能够嵌入到水-油界面中，促进表面活性剂在体系中的分散，从而降低表面张力，提高水-油界面膜的流动性和弹性，同时，它可以溶解在水相和油相中，起到调节两相极性的作用[23]。从图1可知，3种助表面活性剂形成的微乳区域相对面积由大到小依次为无水乙醇＞1,2-丙二醇＞甘油，随着助表面活性剂羟基数量的增加，微乳区域相对面积减小。这可能是由于醇类分子体积的增加不利于水-油界面膜的弯曲，引起微乳结构向液晶相转变[24]。醇类分子在油相中的溶解性提高会抑制水相或油相的极性调节作用，从而更容易产生液晶相[25]。此外，甘油作为助表面活性剂时微乳区域相对面积最小，可能是因为甘油的高黏度和低流动性导致其在水-油界面和水相中的穿透性降低[26]。因此，选择无水乙醇作为助表面活性剂进行后续研究。

图1 助表面活性剂对微乳液形成的影响Fig. 1 Effect of co-surfactant on microemulsion fabrication

2.2.2 表面活性剂对微乳液形成的影响

由图2可知，不同表面活性剂的微乳区域相对面积由大到小依次为吐温60＞吐温80＞吐温40＞吐温20。这一结果与表面活性剂的结构有关，不同的吐温系列表面活性剂，它们每一分子都有20 个环氧乙烷亚基，但疏水链的长度、脂肪酸类型和酯化程度不同，吐温20和吐温40的疏水链长分别为12和16，而吐温60和吐温80的疏水链长为18，但酯化程度有所区别[27-28]。除了以上的因素外，表面活性剂与助表面活性剂、油相的亲和性也会影响微乳液的形成能力和稳定性[29]。因此，选择吐温60作为表面活性剂进行后续研究。

图2 表面活性剂对微乳液形成的影响Fig. 2 Effect of surfactant on microemulsion fabrication

2.2.3Km对微乳液形成的影响

如图3所示，微乳区域相对面积随着Km的增大而增大，Km为3∶1时，微乳区域相对面积达到最大值45.49%。当Km为1∶2时微乳区域相对面积较小，可能是由于混合表面活性剂的乙醇含量较高，大部分的乙醇溶解于水相中，而没有吸附在水-油界面膜上，这降低了界面膜的弹性，使微乳液稳定性下降[30-31]。而Km为2∶1和3∶1时，体系中的表面活性剂含量较高，它们被吸附到界面膜上，提升了界面膜的强度和稳定性，因此微乳区域相对面积较大[30-31]。尽管更大的Km可得到更大的微乳区域相对面积，但过高的表面活性剂用量可能会带来安全性问题，Km为2∶1时微乳区域相对面积略小于3∶1时，且两者都具有Smix＝9∶1和Smix＝8∶2两条水无限稀释线，为了稳定增溶更多的M.EO，因此，选择Km＝2∶1和Smix＝8∶2进行后续研究。

图3 Km对微乳液形成的影响Fig. 3 Effect of Km on microemulsion fabrication

2.3 M.EO-ME的构型表征

图4表示微乳液随水分质量分数变化下的电导率与黏度变化趋势。电导率的变化可以揭示微乳液体系相转变过程。在水分质量分数0～30%范围内，电导率随着水分质量分数的增加而缓慢增加，非离子型表面活性剂与油相将少量的水包裹、隔离，小水滴间很少发生碰撞与接触，因此电导率增加缓慢，微乳液为油包水（water in oil，W/O）型[32]。在水分质量分数30%～60%范围内，电导率随着水分质量分数的增加而快速增加，此时小水滴开始相互碰撞与接触，导电通道逐步完善，因此电导率快速增加，微乳液为双连续（B.C型）构型[32]。在水分质量分数60%～90%范围内，随着水分质量分数增加，电导率增加缓慢，至水分质量分数为70%时达到最高值，随后电导率逐渐下降，此时导电通道已经完全形成，水的增加只会使电导率缓慢增加，且当水分质量分数较大时，会起到稀释作用，从而出现电导率达到最高值后发生下降的现象[32]，微乳液为水包油（oil in water，O/W）型。

随着水分质量分数的变化而发生变化的黏度同样可以表征微乳液的相转变过程。与电导率类似的构型变化规律可以在黏度的变化中观察到，在水分质量分数0～30%范围内，黏度随着水分质量分数升高而逐步升高，微乳液为W/O型；在水分质量分数30%～60%范围内，黏度快速增加后又下降，形成钟型曲线，微乳液为B.C型；在水分质量分数60%～90%范围内，随着水分质量分数增加，黏度缓慢下降，黏度处于较低的范围，微乳液为O/W型。在B.C型区域得到最高的黏度，可能是因为水-油的聚集和内部联结所致，而B.C型到O/W型转变时，可观察到黏度降至较低值，这表明了胶束结构的转变[26]。

图4 M.EO-ME电导率和黏度的变化曲线Fig. 4 Electrical conductivity and viscosity of M.EO-ME as a function of water content

图5展示了水溶性染料亚甲基蓝在微乳液中的扩散情况。与电导率、黏度的变化规律类似，当水分质量分数小于30%的范围内，此时为W/O型微乳液，油相占据体系的主导，且密度比水小，因此亚甲基蓝染料集中在底部；当水分质量分数达到30%～50%时，微乳液构型向B.C型转变，随着水分质量分数的增加，亚甲基蓝染液在体系中的扩散范围逐渐增大；当水分质量分数达到60%及以上，B.C型微乳液转变为O/W型，水相开始占据体系的主导，亚甲基蓝染料扩散得更充分、均匀。综合以上结果以及微乳液构建的目的，选择水分质量分数为70%的O/W型微乳液进行后续的研究。

图5 亚甲基蓝在不同水分质量分数M.EO-ME中的扩散情况Fig. 5 Methylene blue diffusion in M.EO-ME with different water contents

2.4 M.EO-ME的理化性质和稀释稳定性

M.EO-ME的粒径分布结果如图6所示，M.EO-ME在稀释前后均为单峰分布，对比原始状态（即稀释前），稀释后的微乳液粒径分布更集中。由表2可知，M.EO-ME电导率为260 μS/cm，具有较强的导电性；黏度较低，为8.19 mPags，说明体系具有良好的流动性。稀释前的平均粒径为（22.92±0.10）nm，PDI为0.36±0.00，说明体系粒径较小，粒径分布较为均一。稀释后平均粒径与PDI都出现显著下降（P＜0.05）。由于微乳液的粒径大小主要受界面组成和再分布影响，以上的结果可能是因为水相的增加，引起助表面活性剂乙醇在水相中的溶解量增加，总界面面积减小，即两相界面上的乙醇量有所减少，导致粒径变小，粒径分布更为均一[33]。此外，微乳液在经100、200 倍稀释后均未出现分层或絮凝等不稳定的现象。因此，M.EO-ME具有较好的稀释稳定性。

图6 稀释前后的M.EO-ME的粒径分布情况Fig. 6 Particle size distribution of M.EO-ME before and after dilution

表2 M.EO-ME的理化性质Table 2 Physicochemical parameters of M.EO-ME

2.5 M.EO及其微乳液的抗氧化活性评价

2.5.1 DPPH自由基清除能力

如图7A所示，M.EO和M.EO-ME的DPPH自由基清除率与精油含量呈剂量依赖效应，两者的曲线类似，EC50分别为（1.43±0.07）、（1.27±0.11）mg/mL（以精油计）。由图7B可知，M.EO经微乳化处理后DPPH值略有提高，微乳化前后的DPPH值分别为（29.37±5.71）μmol/g和（33.08±7.50）μmol/g，无显著差异（P＞0.05）。由此说明，微乳液的构建并没有影响M.EO的抗氧化活性。

图7 M.EO和M.EO-ME的DPPH自由基清除能力（A）和DPPH值（B）Fig. 7 DPPH free radical-scavenging capacity (A) and DPPH values (B)of M.EO and M.EO-ME

2.5.2 氧自由基清除能力和过氧自由基清除能力

为了研究微乳液对脂溶性精油的水溶性环境改善作用，运用水溶性的ORAC和PSC法以对比评价M.EO和M.EO-ME的抗氧化活性差异。

如图8所示，M.EO和M.EO-ME的ORAC分别为（0.52±0.02）、（1.33±0.12）μmol/mg，PSC分别为（2.95±0.22）、（24.84±1.81）μmol/g。综合ORAC和PSC结果可知，微乳液ORAC和PSC分别显著提升为M.EO的2.6 倍和8.4 倍（P＜0.05），推测微乳液通过改善M.EO的水溶性，从而提高其在水溶性体系中的抗氧化活性。

图8 M.EO和M.EO-ME的ORAC（A）和PSC（B）Fig. 8 ORAC (A) and PSC (B) of M.EO and M.EO-ME

ORAC和PSC方法采用更具生物学相关性的ABAP作为反应的自由基引发剂，能够更好地评价抗氧化活性物对机体由氧自由基和过氧自由基引发的损伤的抑制效果，为M.EO-ME作为保健食品、药物以及日化产品的开发利用提供一定的理论依据[34-35]。

2.6 M.EO和M.EO-ME对A375细胞的细胞毒性和抗增殖活性

M.EO和M.EO-ME对A375细胞毒性和抗增殖活性如图9所示。对比对照组，M.EO和M.EO-ME的抗增殖活性呈剂量依赖关系。M.EO质量浓度为60～360 μg/mL时，细胞毒性最大为（7.26±1.46）%，低于10%，表现出极低的毒性，细胞增殖抑制率（100%－细胞增殖率）最大达（60.05±2.50）%。M.EO-ME质量浓度为10～70 μg/mL时，细胞毒性最大为（9.43±3.65）%，细胞增殖抑制率最大达（59.51±1.15）%，同样在极小的毒性下表现出较好的抗增殖活性。本研究引入选择指数（selective index，SI）以评价M.EO和M.EO-ME的安全性，SI是半数细胞毒性质量浓度（concentration cytotoxicity 50%，CC50）和抗增殖活性EC50的比值，用来反映药物的安全性，若SI大于2，则说明抗增殖活性主要由抗增殖能力引起，反之则主要由细胞毒性作用引起[36]。M.EO和M.EO-ME的EC50分别为（257.10±14.59）μg/mL和（52.43±3.68）μg/mL（以精油计），M.EO-ME的EC50仅为M.EO的约1/5；两者的CC50均未能得到确切数值，分别大于600 μg/mL和大于100 μg/mL（以精油计）；即SI分别大于2.33和大于1.92，根据两者的SI，均可说明它们的抗增殖活性主要由抗增殖能力引起，且M.EO经微乳液包埋后，在毒性没有明显增大的情况下，其抗增殖效果有极大的提升，这可能是因为微乳液改善了M.EO的水溶性，以及表面活性剂的存在和其极小的粒径有助于M.EO透过细胞膜发挥活性作用[37-38]。

图9 M.EO（A）和M.EO-ME（B）对A375细胞毒性和抗增殖活性Fig. 9 Cytotoxicity and anti-proliferative activity of M.EO (A) and M.EO-ME (B) against A375 cells

3 结 论

本实验使用水蒸气蒸馏法提取得到M.EO，其主要组分经GC-MS分析确定为香树烯（25.53%）、β-石竹烯（19.31%）、异石竹烯（11.30%）、甲位葎草烯（8.30%）、佛术烯（7.62%）。以M.EO为油相，运用伪三元相图筛选确定吐温60为表面活性剂，无水乙醇为助表面活性剂，Km＝2∶1，Smix＝8∶2的微乳液。微乳液经100、200 倍水稀释仍保持稳定。最后，对比研究M.EO和M.EO-ME的DPPH自由基清除能力、ORAC、PSC和抗肿瘤细胞增殖活性，发现微乳液在M.EO具有较好的抗氧化和抗肿瘤细胞增殖活性的基础上，显著提高了其ORAC、PSC以及抗肿瘤细胞增殖活性（P＜0.05）。本研究为凉粉草资源的高值化开发与利用提供了新的思路，为M.EO在保健食品、药品和日化产品的开发利用提供了一定的理论参考。关于M.EO的抗增殖机理需要进一步的研究。