自动QuEChERs样品制备系统在中药禁用农药残留检测中的应用

武晓丽 易 鹏 戚 仓 丁自勉

（1.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193；2.北京芥微科技有限公司，北京 102209；3.北京本立科技有限公司，北京 100098）

中药中禁用农药残留不仅会影响中药的质量安全，也是阻碍中药走向国际化的壁垒[1]。为了控制高毒、高风险农药在中药种植过程中的违规使用，达到从源头控制中药质量的目的，在《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版四部《0212药材和饮片检定通则》中，首次规定药材及饮片（植物类）中33种禁用农药不得检出（不得过定量限）[2]，并在《2341农药残留量测定法》中新增了第五法。第五法中采用液相色谱质谱联用检测的农药30种，供试品溶液制备方法3种，包括直接提取法、快速样品处理法（Quick，easy，cheap，effective，rugged，and safe，QuEChERs）和固相萃取法[3]，其中QuEChERs方法是农药残留检测常用的方法之一。

QuEChERs方法由美国科学家ANASTASSIADES等开发[4]，最初用于蔬菜、水果等食品中农药多残留的样品前处理，后经过完善后逐渐成为很多国家和地区的官方分析方法，例如美国AOAC 2007.01[5]、欧盟EN 15662[6]和我国的一些食品安全国家标准[7～9]。近年来，QuEChERs方法在中药材农药残留检测分析中的应用也逐年增多。例如，耿昭等[10]建立了贝母类药材中53种农药残留检测的QuEChERS法结合气相色谱－串联质谱法；宾婕等[11]建立QuEChERS－UPLC－MS/MS法快速测定香茅草中33种农药残留量；熊颖等[12]建立QuEChERSGC－MS/MS法测定化橘红中65种农药残留。QuEChERs方法主要包括两个步骤，第1步，样品经过乙腈振荡提取、盐析后离心分离；第2步，上一步提取液经过分散固相萃取净化后，离心分离。QuEChERs方法重复性好，适用于多种化合物的分析，但是传统的QuEChERs方法是以手动离心分离，这增加了溶剂收集、转移的时间和过程中的污染风险[13]。因此，QuEChERs的自动化是值得科学家们研究改进的方向。

本研究使用了一种新型QuEChERs样品制备系统，其能够自动实现振荡、离心、提取液转移和净化等。该系统对植物源食品如芹菜、番茄、葡萄、玉米、绿茶等基质中大多数农药都有较好的提取效果[14]，但尚未应用于复杂的中药基质。本研究以半夏、金银花、紫苏叶为代表，将该系统用于30种禁用农药残留分析的样品前处理，用超高效液相色谱－串联质谱（UPLC－MS/MS）进行检测，并与手动QuEChERs方法进行对比，对回收率、精密度等方法学指标进行考察，以期为中药农药残留检测提供一种简单、快捷的自动QuEChERs方法。

一、材料与仪器

（一）材料与试剂乙腈（色谱纯，美国Fisher公司），甲酸（质谱级，美国Fisher公司），氯化钠、无水硫酸镁、无水乙酸钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。石墨化碳黑（GCB）、N－丙基乙二胺（PSA）、硅胶、十八烷基硅烷键合硅胶（C18）、禁用农药混合标准品（2～20 mg/L），均购于上海安谱实验科技股份有限公司。中草药样品制备管、QuEChERs萃取盐包、氧化锆振子购于北京芥微科技有限公司，其中样品制备管内管中含无水硫酸镁900 mg、N－丙基乙二胺300 mg、十八烷基硅烷键合硅胶300 mg、硅胶300 mg、石墨化碳黑90 mg。

半夏、金银花、紫苏叶购于药材市场，粉碎后过3号筛，过筛后样品置于－20℃冰箱备用。

（二）仪器LC－20A高效液相色谱仪（日本岛津公司）；5500 QTRAP质谱仪配有电喷雾离子源ESI（美国AB SCIEX公司）；SiO－7512自动QuEChERs样品制备系统（北京本立科技有限公司）。

二、方法与结果

（一）UPLC-MS/MS条件

1.液相色谱条件。色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱（Thermo Scientific Hypersil GOLD，100 mm×2.1mm，1.9μm）。流动相：以乙腈为流动相A，以0.1%甲酸水溶液为流动相B，梯度洗脱（0～0.5 min，70%B；0.5～9 min，70%B～10%B；9～13 min，10%B；13～14 min，10%B～70%B；14～18 min，70%B）。流速为0.20 mL/min；柱温为30℃；进样量为2μL。

2.质谱条件。以三重四极杆串联质谱仪检测；电喷雾（ESI）离子源，监测模式为多反应监测（MRM），正离子扫描。各化合物按照保留时间先后编号，监测离子对、去簇电压（DP）、碰撞电压（CE）见表1。

表1 30种禁用农药的保留时间和多反应监测条件

续表1

（二）混合标准品储备液的配制精密量取禁用农药混合对照品溶液0.5 mL，置于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀备用。

（三）样品前处理方法

1.手动QuEChERs法。参照《中国药典》四部《2341农药残留量测定法》中第五法，取供试品粉末3 g，精密称定，置于50 mL聚苯乙烯具塞离心管中，加入1%冰醋酸溶液15 mL，涡旋使药粉充分浸润，放置30 min，加入乙腈15 mL，涡旋混匀，置振荡器上剧烈振荡5 min（500次/min），加入无水硫酸镁与无水乙酸钠的混合粉末（比例为4∶1）7.5 g，立即摇散，再置振荡器上剧烈振荡3 min（500次/min），于冰浴中冷却10 min，离心5 min（4 000 r/min）。取上清液9 mL，置分散固相萃取净化管（含无水硫酸镁900 mg、N－丙基乙二胺300 mg、十八烷基硅烷键合硅胶300 mg、硅胶300 mg、石墨化碳黑90 mg）中，涡旋使充分混匀，置振荡器上剧烈振荡5 min（500次/min），离心5 min（4 000 r/min）。精密吸取上清液5 mL，置氮吹仪上于40℃水浴浓缩至约0.4 mL，加乙腈稀释至1.0 mL，精密加入0.3 mL水，涡旋混匀，过0.22μm滤膜，待测。

2.自动QuEChERs法。取供试品粉末3 g，精密称定，置于70 mL样品制备管中，加入1%冰醋酸溶液15 mL，涡旋使药粉充分浸润，放置30 min，加入乙腈15 mL、氧化锆振子和QuEChERs萃取盐包（含无水硫酸镁6 g、无水乙酸钠1.5 g），立即摇散。将样品制备管放入自动QuEChERs样品制备系统，参照《中国药典》中的振荡和离心条件，设置振荡转速为500 r/min，处理时间300 s，离心转速为4 000 r/min，处理时间300 s。点击运行，系统按照以下程序自动处理：第1步，振荡，转速为500 r/min；第2步，离心，转速为4 000 r/min；第3步，振荡，转速为500 r/min；第4步，离心，转速为4 000 r/min。各步处理时间均为300 s。运行结束后，精密吸取制备管内管中的上清液5 mL，置氮吹仪上于40℃水浴浓缩至约0.4 mL，加乙腈稀释至1.0 mL，精密加入0.3 mL水，涡旋混匀，过0.22μm滤膜，待测。

（四）加样回收试验本研究以半夏、紫苏叶、金银花为代表性药材，验证自动QuEChERs方法用于中药禁用农药残留分析的方法准确度和重复性，并与手动的QuEChERs法进行对比。根据2020年版《中国药典》，禁用农药的限量值在0.02～0.2 mg/kg范围内（见表2）。本研究选取限量值附近的浓度，平行6次进行加样回收试验。具体方法为：取供试品粉末3 g，精密称定，添加0.3 mL禁用农药混合对照品，平行6份，分别根据上文所述的手动QuEChERs法和自动QuEChERs法进行样品处理，30种农药在3种基质中的回收率和相对标准偏差（RSD）结果见表2和图1。

图1 半夏、金银花、紫苏叶中禁用农药的回收率结果及分布情况（手动和自动QuEChERs方法比较）

表2 经手动或自动QuECHERs处理的半夏、金银花、紫苏叶中禁用农药的回收率和相对标准偏差 （n＝6）

（五）方法的线性和检测限本研究根据《中国药典》四部《2341农药残留量测定法》中第五法制备混合对照溶液，进行方法的线性和定量限的考察。取空白样品粉末3 g，精密称定，然后按照上文所述的自动QuEChERs法制备空白溶液。精密量取空白基质溶液1.0 mL（6份），置氮吹仪上，40℃水浴浓缩至0.6 mL，分别加入混合对照品溶液10、20、50、100、150、200μL，加乙腈稀释至1.0 mL，精密加入0.3 mL水，涡旋混匀，过0.22μm滤膜，待测。取标准曲线最低点，计算信噪比为10∶1时的相应浓度，得到方法定量限（LOQ）。30种农药在3种基质中的线性范围、线性方程、线性相关系数（r）及定量限见表3。

表3 自动QuEChERs系统用于中药中禁用农药分析的线性范围、线性相关系数和定量限

续表3

三、讨论

（一）加样回收率和精密度根据《中国药典》四部《9101分析方法验证指导原则》[3]和王晓蕾等[15]提出的中药有害残留物分析中质量控制指导原则，残留物检测分析方法的准确度多采用加样回收的方式进行确认。加样回收试验可采用最大残留限量（MRL）所处的浓度进行6次平行试验。回收率应在70%～120%之间，在满足重复性要求的情况下（RSD一般应≤15%），部分农药回收率可放宽至60%～130%[3，15]。

本研究分别从根茎类、花类、叶类药材中选择1种代表性药材，即半夏、金银花、紫苏叶，进行加样回收试验，并将自动QuEChERs与手动QuEChERs方法对比，结果见表2。结果显示，自动QuEChERs方法处理后，3种药材中禁用农药的回收率为65.6%～103.7%，RSD为0.4%～9.8%；手动QuEChERs方法处理后，3种药材中禁用农药的回收率为66.1%～105.6%，RSD为0.2%～9.8%。两种方法的相对标准偏差（RSD）都＜15%，30种禁用农药的回收率均在60%～130%之间，能够满足分析方法的要求。

3种药材中禁用农药的回收率结果分布情况见图1和表2。半夏基质中自动QuEChERs方法的回收率在65.6%～98.4%之间，手动QuEChERs方法的回收率在68.7%～101.0%之间，两种方法的回收率范围基本一致，但自动QuEChERs方法的回收率相对更加集中。金银花基质中自动QuEChERs方法的回收率在66.6%～103.7%之间，手动QuEChERs方法的回收率在66.1%～105.6%之间，两种方法的回收率范围基本一致，但与半夏基质中不同的是，回收率结果分布均相对离散。紫苏叶基质中自动QuEChERs方法回收率在69.7%～97.8%之间，手动QuEChERs方法的回收率在68.0%～98.2%之间，两种方法的回收率范围基本一致，与半夏基质类似的是，自动QuEChERs方法的回收率相对集中。综上所述，在不同的基质中，自动QuEChERs方法与手动QuEChERs方法的回收率范围基本一致。

除了以上结果外，两种方法的结果都表明，不同基质中杀虫脒（编号5）的回收率都相对偏低，甚至＜70%。除了提取过程存在损失外，可能是过量的净化吸附剂会对部分农药产生吸附，造成回收率降低。因此建议中药中禁用农药残留分析方法建立时，对吸附剂种类和用量进行优化，笔者也将在后续试验中对净化剂用量及吸附机理进行更深入的研究。

（二）自动QuEChERs方法的线性和定量限方法的线性和灵敏度是建立残留分析方法的关键技术环节。方法确认时，限量值所处的浓度一般应在校准曲线的中间或者偏上的位置，线性范围应尽量覆盖预期的浓度范围，校准曲线的相关系数（r）一般不低于0.990。分析方法的灵敏度用检出限（LOD）或者定量限（LOQ）表示。一般以信噪比为10∶1时的相应浓度为定量限（LOQ），以信噪比为3∶1时的相应浓度为检测限（LOD）[3，15]。

在本研究中，方法的线性范围参照《中国药典》四部《2341农药残留量测定法》第五法制备混合对照溶液进行考察，方法的线性范围、线性相关系数（r）和方法定量限结果见表3。半夏基质中r在0.995 0～0.999 8之间，金银花基质中r在0.995 5～0.999 8之间，紫苏叶基质中r在0.995 2～0.999 9之间，3种不同基质中的禁用农药的线性相关系数都大于0.990，有较好的线性，能够满足分析方法的要求。自动QuEChERs方法用于30种禁用农药分析的定量限（LOQ）结果见表3。结果表明，采用该方法处理后，不同基质中所有农药的LOQ都小于农药的限量值，能够用于中药中禁用农药残留的定量检测。

（三）方法自动化手动QuEChERs方法需要完成3次振荡（药典方法振荡时间分别为5 min、3 min和5 min）和两次离心（各5 min）过程，虽然目前已经有批量振荡的多管涡旋振荡仪器，但仍需要手动完成振荡和离心步骤的样品转移，此外还需要手动将提取液定量转移至分散固相萃取净化管中，10个样品的处理过程约为60 min。

自动QuEChERs样品制备系统在主机上能够通过自动程序控制，可单次有效地实现样品中待测成分的振荡提取和离心分离[14]。与其配套使用的样品制备管，包括内管和外管两部分，外管用于样品提取，内管中有净化吸附剂，内管壁上有0.22μm的聚四氟乙烯膜，由于疏水作用，乙腈提取液在离心作用下进入内管，实现定量的转移和净化。该系统一次处理10个样品，整个流程时间约为25 min。在此过程中无需人工操作，仪器自动完成振荡、离心和提取液的定量转移。

综上所述，本研究采用的自动QuEChERs样品制备系统能够实现QuEChERs方法的自动化，节约时间，降低劳动强度。

四、结论

本研究将一种新型的自动QuEChERs样品制备系统用于中药中禁用农药残留测定的样品制备，该方法与手动QuEChERs方法的准确性结果一致，且重复性、线性、定量限满足分析方法要求。除此之外，该系统能够自动完成提取和净化过程，无需人工操作，能够节省时间、减少劳动力、减少人为操作误差，在中药农药残留检测方面有着良好的应用前景。