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基于气相色谱-质谱联用技术测定脂肪酸的方法研究进展

2022-05-28王会锋冯书惠周其芳李圆圆李淑芳郝学飞

农产品质量与安全 2022年3期
关键词:甲酯内标质谱

王会锋 冯书惠 周其芳 李圆圆 李淑芳 郝学飞

(河南省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,农业农村部农产品质量监督检验测试中心,农业农村部农产品质量安全风险评估实验室,郑州 450002)

脂肪酸(Fatty acids,FA)是一类羧酸化合物,由碳氢组成的烃类基团连接羧基构成。脂肪酸作为中性脂、磷脂和糖脂等脂质的组分,又被称为脂肪酸酯或总脂肪酸,通常以酯化形式存在。酯化脂肪酸在磷脂酶作用下水解得到游离脂肪酸,游离脂肪酸为非酯化的脂肪酸,是类脂代谢物的重要组成部分。

目前,有关脂肪酸的研究日益增多。脂肪酸关乎人体健康,其会影响机体的生理功能及健康状态,与炎症、肥胖、糖尿病、癌症、心血管硬化等疾病存在一定的关系[1]。脂肪酸组成关乎农产品营养品质,农业科学家试图选育出高油酸的花生品种,以期提升植物油品质和货架寿命[2]。根据油脂脂肪酸组成,可以鉴定食用油掺伪[3~4],打击食用油非法添加,保护消费者权益。对反式脂肪酸检测,可以打击不法商贩添加氢化植物油[5]和滥用地沟油[6],保护人体健康。随着脂肪酸检测技术的提高,检测更为精准,应用更为广泛。

脂肪酸检测技术主要有近红外光谱(NIRS)法[7]、气相色谱(GC-FID)法[8~9]、气相色谱-质谱联用(GC-MS)法[10]、高效液相色谱(HPLC)法[11]、高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)法[12]、核磁共振波谱(NMR)法[13]。其中,气相色谱法是应用最为广泛的脂肪酸检测方法,由于其检测方便、分离效果好、灵敏度高、检出限低,因此现行有效的方法标准[14~18]多是气相色谱法。随着气相色谱-质谱联用技术推广普及,GC-MS测定脂肪酸的研究也越来越多,已形成了方法标准[19]。GC-MS有较好的定性定量能力,研究人员从质谱得到大量碎片信息后,通过标准谱库可以进行结构鉴定;同时,选择离子扫描(SIM)模式定量能有效去除干扰,提高灵敏度。本文综述了气相色谱-质谱联用法测定脂肪酸的方法研究进展,比较了前处理技术的特点,对样品水解、脂肪提取、脂肪皂化、脂肪酸甲酯化等步骤进行分析;重点介绍了色谱优化和质谱条件设置、数据处理等策略;最后介绍了GC-MS测定脂肪酸的代表性应用,为高通量、高灵敏度的脂肪酸分析方法的发展提供参考。

一、脂肪酸检测方法概述

红外光谱法检测脂肪酸简便快速,对样品无损伤,但只能获得脂肪酸总量。HPLC法利用荧光或紫外检测器检测,方法响应灵敏度低,存在应用局限。HPLC-MS法和NMR法检测成本昂贵。目前脂肪酸检测最可行的方法是GC-FID法和GC-MS法。

GC-FID法基于待测组分沸点、极性差异进行气相色谱柱分离,组分依次流出,FID检测器检测。该方法依据标准品的保留时间定性,一般出峰时间相同即为同一化合物,但保留时间吻合也可能是干扰物质,遇到无标样确认的未知峰,定量结果有偏差。

GC-MS法是基于气相色谱的高效分离能力和质谱的准确鉴定能力而开发的分析技术,其应用于脂肪酸检测有一定优势。GC-MS法可借用GCFID法成熟的前处理技术,二者仅检测器不同,同一前处理获得的待测液可分别供GC-FID和GCMS分析。GC-MS法除了可利用标准物质的保留时间定性,也可以依据质谱图碎片信息进行定性,其能够对除标准品之外的组分,通过提取不同特征离子进行鉴定和定量[20~22]。GC-MS法比GC-FID法获得的检出限(定量限)更低,结果更加准确,两种方法的比较见表1。

表1 GC-FID与GC-MS测定脂肪酸的方法比较

二、气相色谱-质谱联用法测定脂肪酸的相关研究

GC-MS法测定脂肪酸,一般需要经过样品水解→脂肪提取→脂肪皂化→脂肪酸甲酯化→仪器分析→数据处理等步骤。

(一)样品前处理样品前处理通常包括水解、提取和酯化,要求水解彻底、提取充分、酯化完全,减少干扰基质,保证后续检测结果的灵敏性和准确性。

1.脂肪提取。脂肪的存在形式有游离态(如动植物油脂)和结合态(乳粉及液态乳),其中游离态脂肪可通过有机溶剂直接提取[8]或者索氏提取[23];结合态脂肪提取则需要先破坏脂肪与非脂成分的结合力(壁),即采取水解方法。水解方法分为酸水解法、碱水解法、酸碱水解法3种[14],根据基质不同选择不同方法。林麟等[24]分别用酸水解法和碱水解法对奶粉标准参考物进行脂肪测定比较,碱水解法的结果与标准值最接近,酸水解法的结果偏低。田春霞等[25]考察了采用酸水解法、碱水解法、酸碱水解法对婴幼儿奶粉脂肪提取率的影响,结果显示,提取率分别为16.89%、19.14%和15.21%,碱水解法的提取率较高。

鉴于环保节能以及前处理技术和仪器的发展,环保高效的脂肪提取技术被应用于不同基质脂肪酸的提取、净化。有关文献中报道的以不同的脂肪提取技术提取不同基质中脂肪的应用情况见表2,相比而言,SPE、ASE、MAE、UAE、DLLME均能够比LLE缩短萃取时间、减少溶剂用量,但ASE设备的维护费用较高,MAE可能会导致不饱和脂肪酸发生氧化,限制了其在脂肪酸分析中的应用。UAE、DLLME不改变萃取体系温度,有利于萃取脂肪酸等热稳定性差的物质。

表2 不同脂肪提取技术应用情况

2.脂肪酸甲酯化。脂肪提取物主要是甘油三酯,需进一步皂化成脂肪酸。脂肪酸因含羧基等极性基团,极性大,沸点高,不能直接用GC-MS进行分析,需要将其衍生化为低极性、易挥发的脂肪酸衍生物,以提高检测灵敏度、改善色谱分辨率和减少长链脂肪酸色谱峰拖尾等。衍生方式有甲酯化、异丙酯化、丁酯化、硅烷化、胺化和酰化等。甲酯化即脂肪酸生成脂肪酸甲酯(FAMEs),其反应简单,挥发性好,是目前最常用的脂肪酸衍生化方式[33]。脂肪酸甲酯化主要有5种方法,目前文献中报道的脂肪酸甲酯化的应用情况见表3。对比国家标准[14]中奶粉脂肪酸甲酯化的3种方法,乙酰氯-甲醇法优于碱酯化法和酸酯化法[39]。刘文媛等[40]比较了6种牦牛骨脂质甲酯化方法,结果显示,应用碱酯化法衍生后脂肪酸几乎无检出,应用乙酰氯-甲醇法衍生后测得的脂肪酸总含量显著高于硫酸-甲醇法和盐酸-甲醇法。

表3 不同脂肪酸甲酯化方法应用

(二)色谱和质谱条件优化

1.色谱条件优化。色谱分离受色谱柱型号、色谱柱温度、色谱柱流量(进样口压力)、载气类型、进样量、分流比和进样浓度等影响[41]。色谱柱是决定分离效果的最核心部件,合适的色谱柱可显著改善分离度和分离效率,强极性的色谱柱对FAMEs的分离能力优于中等极性、弱极性色谱柱。国家标准[14~15]推荐的脂肪酸分析使用的色谱柱是HP-88和SP-2560,规格是100 m×0.25 mm×0.20 μm,若柱长度再增加,其分离能力愈增强,但分析时间则会增长。

FAMEs出峰顺序有一定规律性[20,24]:饱和类脂肪酸甲酯,碳原子数小的先于碳原子数大的出峰;碳原子数相同的脂肪酸甲酯,饱和类先于不饱和类出峰;不饱和类脂肪酸甲酯,不饱和度越大,出峰越晚;顺反异构体的脂肪酸,反式脂肪酸先出峰。相同类型的色谱柱,FAMEs出峰顺序基本一致,但有个别组分的保留时间存在差异,CP-Sil 88和BPX-70相比,C20∶1与C18∶3的流出顺序正好相反[42]。同样,相同型号的HP-88色谱柱也存在这个情况,国 家 标 准[14]中 所 列 的 出 峰 顺 序 为C20∶3n3>C22∶1n9、C20∶5>C24∶0,不同于杨明等[20]实验得到的出峰顺序(C22∶1n9>C20∶3n3、C24∶0>C20∶5)。 推测原因有两方面:一是不同批号色谱柱分离效果具有不一致性[41],对于保留时间接近的组分影响较大;二是载气类型对分离顺序的影响,国家标准方法[14]选用氮气为载气,GC-MS[20]使用氦气作为载气。考虑到柱子间和色谱条件差异,须使用单标准品监测混合标准样的出峰顺序,来确定混合标准品中各组分的保留时间。

脂肪酸甲酯分析可以在恒温条件下完成[43],但程序升温分离更佳,初始温度设定为60~120℃,以3~20℃/min升温速率升至最高温度。当进样量太大时,比起样品稀释,调整进样体积和分流比是更为快捷的手段[44]。

2.质谱条件优化。质谱优化参数主要有离子源温度、四极杆温度、传输线温度、溶剂延迟时间、SIM特征离子等。扫描模式有全扫描(SCAN)、选择离子扫描和多反应监测扫描(MRM)。GC-MS测定脂肪酸多是SCAN模式,采用保留时间和全扫描的质谱离子信息定性,面积归一化法[19]或者外标法[45]定量。全扫描模式对测定有较大的背景干扰时,选择GC-MS-SIM测定脂肪酸[20~22],SIM模式有一定抗干扰能力,背景干净,灵敏度高,有利于低含量的脂肪酸检测。目前,多反应监测扫描模式检测脂肪酸还未见文献报道。

FAMEs质谱裂解规律[20,24]:根据基峰荷质比判定不饱和度,饱和脂肪酸甲酯、单不饱和脂肪酸甲酯、双不饱和脂肪酸甲酯、3个以上双键不饱和脂肪酸甲酯的基峰荷质比依次是74、55、67、79;随着碳链及不饱和度增加,其分子离子峰的丰度逐渐减弱;分子峰(M)断裂产生M-43、M-32、M-31、M-29的碎片离子依次为饱和脂肪酸甲酯、单不饱和脂肪酸甲酯、双不饱和脂肪酸甲酯、4个以上双键不饱和脂肪酸甲酯的特征离子。根据脂肪酸甲酯全扫描得到总离子流图(TIC)和质谱裂解规律,选择基峰离子、分子峰离子及其他特征离子为定性离子和定量离子。

杨明等[20]建立的GC-MS-SIM方法双内标定量检测脂肪酸的时间为GB 5009.168标准方法检测时间的1/2。孙翠霞等[21]用于食品中脂肪酸含量准确测定的方法与国家标准方法[14]的测定结果无差异。参考杨明等[20]和林麒等[24]的研究成果,本文推荐各脂肪酸甲酯的特征离子信息见表4。

表4 各脂肪酸甲酯的特征离子信息

(三)定量方法前处理是实现脂肪酸准确分析的基础,而仪器分析是定性定量分析的关键。常用的脂肪酸定量方法有3种,即归一化法[19]、外标法[25]和内标法[20],结果以相对含量或者绝对含量表示。《中国食物成分表》(第6版)[47]记录的脂肪酸含量是绝对含量(单位为g/100 g),归一化法测定的脂肪酸结果是相对含量(%),二者除单位不同外,数值差异也较大。

归一化法是对所有组分进行归一化,求得相对含量。该方法的优点是可以不需要标准品,不要求精确进样,一次进样就可以完成分析;缺点是必须保证样品中所有组分都出峰。FAMEs在仪器上的响应因子接近时,直接对色谱图中峰面积归一化;当响应因子差别较大时,采用校正因子计算结果更准确。GB 5009.257-2016[15]附录C中列出了各脂肪酸甲酯GC-FID响应因子及相对于C16∶0的校准因子(均是理论计算值),其中C14∶0~C22∶6响应因子为1.30~1.44,与十四碳以下脂肪酸甲酯响应因子差别较大。研究人员所在实验室根据不同浓度的脂肪酸甲酯的仪器响应面积计算出GC-FID校准因子(实测值),该实测值和标准[15]中理论值误差在5%以内。关于GC-MS的校正因子,实测值和理论值的比较还未有研究报道。

GC-MS测定脂肪酸绝对含量有外标法和内标法两种定量方法。采用内标法时可选1种脂肪酸作为内标, 如C11∶0、 C19∶0、 C21∶0、 C23∶0[47]等; 也可以选2种脂肪酸共同作为内标,如C13∶0和C21∶0,C13∶0作为碳原子数<18的FAMEs的内标,而C21∶0则作为碳原子数>18的FAMEs的内标[20]。关于内标的加入时间,一种是在脂肪酸甲酯化衍生时添加脂肪酸内标物,校正不同脂肪酸在仪器上浓度和响应值关联的误差[20];另一种是添加脂肪酸甘油三酯于样品中作为内标,和试样一起前处理,校正前处理带来的损失,有回收率校正作用[14]。内标法计算,需要FAMEs响应因子和FAMEs转换成FA的系数,FAMEs峰面积与FAMEs浓度、种类和色谱条件密切相关。杨明等[20]对混标中FAMEs的浓度与内标浓度比乘以内标峰面积与FAMEs峰面积比计算出FAMEs响应因子。

(四)数据处理GC-MS获得的数据,利用Excel、SPSS软件进行分析,P<0.05表示具有显著性差异,所用描述性统计值均采用平均值±标准偏差(x±s)表示。对数据进行标准化后,结合化学计量学,运用代谢组学、数学统计等方法分析和处理软件绘图,得到主成分得分图、脂肪酸热图、区域分布三维图等直观图,用于品质分析、产地溯源和鉴别掺假等研究[48~51]。

郭敏等[48]为研究国内外不同产地藜麦的成分差异,采用GC-MS技术对藜麦中脂肪酸及非极性小分子物质进行测定,并结合无监督模式的主成分分析(PCA)和有监督模式的正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)对产地与成分之间的相关性进行分析。通过PCA得分散图上散点位置的分布可以比较直观地展现样品或组别之间的差异。采用有监督模式的OPLS-DA,对不同产地的藜麦样品按照产地进行分组,可对藜麦中小分子物质与产地之间的相关性进行分析。

张勇等[51]测定进口大豆、国产大豆和掺假大豆的脂肪酸组成,利用主成分分析、系统聚类分析对进口大豆和国产大豆样品进行聚类分析,结果显示进口大豆与国产大豆油酸、亚麻酸、棕榈酸、棕榈油酸等脂肪酸相对含量存在极显著差异;利用脂肪酸组成可实现进口和国产大豆正确聚类。他们还利用随机森林方法建立了进口大豆与国产大豆、掺假大豆与国产大豆间的判别模型,该模型可有效区分进口大豆与国产大豆、掺假大豆与国产大豆,采用随机森林交互检验预测正确率均为100%。

三、脂肪酸检测技术的应用与展望

纵观脂肪酸检测技术应用,主要用于医学健康、油脂资源、安全监管、产地溯源、生物生理等方面。在医学健康方面,因为生物样本中脂肪酸含量与疾病有一定相关性,脂肪酸检测可应用于脂肪酸代谢相关疾病的诊断,以便人们及时调整膳食营养[52]。在油脂资源方面,脂肪酸的种类、含量、比例决定了油脂的品质和利用,脂肪酸检测可用于新油脂资源的发现、替代,使其变废为宝。在安全监管方面,产品标准规定了脂肪酸的含量及相关检测标准,可以严控产品质量。在产地溯源方面,不同来源的样品中脂肪酸组成具有明显区别特征,基于脂肪酸深挖营养差异,可凸显地理标志产品、名特优新农产品营养特色[48~51]。在生物生理方面,脂肪酸检测技术可为动植物脂质的代谢研究、脂质生物学功能研究提供分析技术平台[53~54]。

对于更复杂组分,GC-MS的MRM模式相比SCAN和SIM模式,有更强抗干扰能力,结果更加准确。但SCAN质谱图中丰度较高的离子荷质比较小(如m/z55、69、74),不适合作为MRM母离子,选择MRM离子对,还需要进一步研究。对于反式脂肪酸检测,全二维气相色谱-质谱具备较强的分离能力,提供了新的技术手段[55]。此外,也有采用液质联用[56]、液相色谱-飞行时间-串联质谱[54]检测脂肪酸的研究报道。获得的数据结合化学计量学、代谢组学等分析方法,将会给脂肪酸检测带来新发现和新应用。

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