氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺对斑马鱼胚胎氧化应激的影响

贺琳娟 张 琳 李亚梦 卯明彩 钱永忠 邱 静

（中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业农村部农产品质量安全重点实验室，北京 100081）

氟苯尼考（Florfenicol，FF）又称氟甲砜霉素，属于第3代酰胺醇类抗生素，与氯霉素相比不再具有致再生障碍性贫血的毒副作用。氟苯尼考具有抗菌活性高、抗菌范围广、毒副作用小的优点，被广泛用于畜禽和水产动物养殖生产中，从而容易进入水体在食物链中富集[1]。BU等[2]的研究结果表明，氟苯尼考在地表水中的浓度范围为14.8～46.6 ng/L。ZONG等[3]对我国大连的水产养殖场附近水样进行调查，其中检测到29.8～1.1×104μg/L的氟苯尼考，而在沉积物中并未检测到。LU等[4]在我国胶州湾河口水中测得的氟苯尼考浓度范围为4.95～64.80 ng/L，海湾水中为2.90～25.70 ng/L。在动物源性食品中，氟苯尼考的检出率较高，禽蛋中氟苯尼考残留超标的情况时有发生[5]。长期食用氟苯尼考超标的食品会对人体健康造成潜在威胁，因此有必要对其毒性作用展开深入研究。

氟苯尼考进入动物体内会产生代谢物。在牛体内氟苯尼考会产生氟苯尼考胺、单氟苯尼考、氟苯尼考草酸和氟苯尼考醇，其中氟苯尼考胺（Florfenicol amine，FFA）是主要的代谢物[6]。研究表明，一些化合物的母体和代谢物在毒性上存在着一定的差异，两种化合物在结构上虽具有相似性，但由于化学基团的改变，其理化性质也会随之发生变化[7～8]。YANG等[9]比较了FF和FFA在3种不同温度下的药代动力学过程，发现FF在25℃下被吸收和消除的速率更快，这说明FF和FFA的理化性质不同。

近年来，由于水环境及食品基质中氟苯尼考残留的不断检出，关于氟苯尼考的毒性研究也在显著增加。急性毒性研究结果表明，氟苯尼考对微藻的96 h半数抑制浓度（IC50）为6.06 mg/L[10]，对罗非鱼幼鱼的96 h半数致死浓度 （LC50）为349.94 mg/L[11]。此外，氟苯尼考也会对小鼠的肠道黏膜屏障、免疫系统以及肠道微生物产生负面影响[12]。在水产养殖中，氟苯尼考会影响非目标生物的光合作用，抑制微藻生长[13～14]。在环境浓度下，氟苯尼考会引起罗非鱼幼鱼的微核及其他红细胞核异常[15]，使斑马鱼体内产生代谢紊乱[16]。在畜禽养殖中，氟苯尼考会抑制鸡胚胎的发育，诱导早期胚胎死亡，具有一定的胚胎毒性[17]。同时，其暴露会引起肉鸡脂质过氧化和凋亡性肝损伤[18]。治疗剂量下的氟苯尼考会引起造血细胞和淋巴细胞浓度降低，影响造血和免疫功能，但随着时间的推移，这种变化会得到缓解[19]。因此，研究氟苯尼考和氟苯尼考胺的毒性效应差异，具有重要的现实意义。

斑马鱼作为世界上第3大模式生物，其胚胎透明易观察、产卵量大、发育周期短，并且与人类基因具有87%的高度同源性，被广泛用于毒理学领域的研究中[20～21]。LEE等[22]以斑马鱼为模式生物，研究了多种有机氯农药的线粒体毒性机制，对耗氧量、线粒体复合体活性、抗氧化反应等指标进行了全面的分析和评估。NI等[23]探究了马杜霉素对斑马鱼产生的急性毒性、组织病理学损伤和氧化应激损伤。通过获取生物标志物的含量信息，研究人员揭示了莫西菌素对斑马鱼早期生命阶段的影响[24]。

目前的研究主要聚焦于氟苯尼考，而针对其代谢物的毒性研究报道仍较少。本文以斑马鱼为模式生物，从氧化应激损伤入手，探索氟苯尼考及其主要代谢物氟苯尼考胺影响斑马鱼胚胎发育及氧化应激的潜在机制，并分析两种化合物的毒性效应差异，为食品安全监管和风险评估提供理论参考依据。

一、材料与方法

（一）试剂与仪器氟苯尼考标准品（CAS：73231－34－2，纯度>99.0%，德国Dr.Ehrenstorfer公司）；氟苯尼考胺标准品（CAS：76639－93－5，纯度>99.0%，德国Dr.Ehrenstorfer公司）；二甲基亚砜（DMSO，纯度99.9%，北京百灵威科技有限公司）；Bradford蛋白浓度测定试剂盒、活性氧检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒（JC－1）、生理盐水（碧云天生物技术有限公司）；还原性谷胱甘肽（GSH）测定试剂盒、丙二醛（MDA）测试盒（南京建成生物工程研究所）；吖啶橙（AO）染料、三卡因、甲基纤维素（北京索莱宝科技有限公司）。

斑马鱼养殖系统（上海海圣生物实验设备有限公司）；人工气候箱（宁波江南仪器厂）；光学显微镜［SZX2－ILLT，奥林巴斯（中国）有限公司］；荧光显微镜［SZX7，奥林巴斯（中国）有限公司］；酶标仪［Infinite 200 Pro，帝肯（上海）贸易有限公司］；超声破碎仪（Q800R3，美国QSonica公司）。

（二）实验动物成年斑马鱼（AB型）购自国家斑马鱼资源中心，养殖水温控制在（28±2）℃，光周期14 h/10 h（光/暗），每天饲喂两次饲料和丰年虾。按照雌雄比为1∶1的比例分隔两室置于产卵盒内，第2天早上9∶00抽取隔板。在显微镜下挑选同一时期且发育正常的胚胎，用于后续的实验操作。

（三）实验方法

1.斑马鱼胚胎染毒。将受精后4 h（Hour post fertilization，hpf）的斑马鱼胚胎，随机放入12孔板内，每孔20颗。用胚胎培养水和二甲基亚砜（最终浓度0.1%）配制1 000 mg/L的母液，并逐级稀释至实验浓度。向12孔板内分别加入2 mL浓度为0、0.01、0.1、1、10、100 mg/L的氟苯尼考和氟苯尼考胺暴露液，其中每个浓度设置3组平行。为确保暴露液浓度的稳定性，每隔24 h更换1次暴露液。在人工气候箱内28.5℃连续培养120 h。

2.形态学观察。在药物暴露后24 h（Hour post exposure，hpe）记录胚胎的死亡数，并统计48、72 hpe的孵化数以及72、96、120 hpe的心跳次数。在120 hpe用三卡因麻醉仔鱼，甲基纤维素固定，对斑马鱼进行拍照观察，并记录相应的畸形情况。

3.氧化应激指标测定。收集一定量的斑马鱼仔鱼样本，设置3个平行重复，放入冻存管内，液氮速冻5 min，－80℃保存。样本置于冰上化冻后，按照质量（mg）：体积（μL）＝1∶9的比例，加入生理盐水超声破碎制成10%组织匀浆液。酶活性测定的具体操作步骤遵循试剂盒说明书，需首先检测样本组织中蛋白质的含量，随后开展过氧化氢酶（CAT）、还原型谷胱甘肽（GSH）活性的测定和丙二醛（MDA）含量的测定。

4.活性氧测定。在药物暴露后120 h，利用荧光探针DCFH－DA法检测斑马鱼活性氧（ROS）的含量变化，具体步骤参考试剂盒说明书及相关文献[25～27]。本实验采用浓度为40μmol/L的DCFHDA探针，在28.5℃避光下孵育斑马鱼仔鱼30 min。然后用胚胎培养水清洗3次，用三卡因麻醉，甲基纤维素固定，在荧光显微镜下拍照记录。

5.吖啶橙染色。参照试剂说明书，将吖啶橙（AO）染料配制为一定浓度的工作液。然后将120 hpe的斑马鱼仔鱼置于28.5℃避光孵育30 min。之后用胚胎培养水清洗，摇床轻摇10 min，重复两次。麻醉并固定好后，在荧光显微镜下观察。

6.线粒体膜电位测定。为了进一步探究凋亡发生的时间，同时测定了线粒体膜电位 （JC－1）。JC－1从红色荧光到绿色荧光的转变，说明线粒体膜电位的破坏。将染料稀释至合适的倍数，在28.5℃下避光孵育斑马鱼仔鱼30 min。随后用胚胎培养水清洗，摇床轻摇10 min，重复2～3次。在荧光显微镜下拍摄图像并记录。

（四）数据分析数据绘图用GraphPad Prism 8，组间显著性差异用IBMSPSS Statistics 26进行单因素ANOVA分析，数据均以平均值标准误差（SEM）形式表示。

二、结果与分析

（一）对斑马鱼胚胎发育的影响与空白对照组相比，FF和FFA对斑马鱼胚胎的孵化产生了不同程度的影响（见图1）。其中，药物暴露48 h后，FF暴露组未出现显著影响，FFA暴露组在100 mg/L剂量下对孵化率的影响显著降低。72 h后，FF暴露组与对照组相比未出现显著变化，而FFA暴露组在0.01 mg/L的浓度下明显降低。结果表明，48 hpe斑马鱼胚胎对FF的敏感性更强，然而随着时间的推移，药物的影响逐渐减弱，因此推测48 h是这两个药物对斑马鱼胚胎孵化率产生影响的关键时间点。

图1 氟苯尼考和氟苯尼考胺暴露后48 h和72 h斑马鱼胚胎的孵化率

分别在暴露后不同时间内统计斑马鱼仔鱼的心率变化，随着暴露时间的延长，各浓度组仔鱼的心率下降（见图2）。与对照组相比，药物暴露后72 h和96 h斑马鱼仔鱼的心率明显增加，说明影响更明显；120 h心率略有下降，说明随着时间的延长，FF和FFA对斑马鱼心脏发育的影响减弱。

图2 氟苯尼考和氟苯尼考胺暴露后72 h、96 h和120 h斑马鱼仔鱼的心率

为进一步探究药物对斑马鱼发育的影响，对暴露后120 h斑马鱼仔鱼的体长及发育畸形情况（主要为鱼鳔缺失）进行统计分析（见图3）。如图3所示，两种药物的影响程度各有不同。FFA会减少鱼鳔缺失发生的比例，且在0.1 mg/L的浓度下引起斑马鱼体长变短。而FF则会略微增加鱼鳔缺失发生的比例，但无显著性差异。

图3 暴露后120 h氟苯尼考和氟苯尼考胺对斑马鱼鱼鳔缺失相对发生率和相对体长的影响

（二）对氧化应激的影响基于以上对斑马鱼胚胎发育的形态学观察结果，为探究两种药物影响斑马鱼胚胎发育的内在机制，测定了氧化应激相关指标（见图4）。如图4所示，与对照组相比，经过药物暴露120 h后，处理组均会对斑马鱼胚胎的氧化应激产生影响。CAT活性在100 mg/L FF处理下呈现显著降低的趋势，而FFA处理组则在1 mg/L的浓度下显著增加。MDA含量在FF处理后显著增加，而FFA处理后未出现显著变化。GSH的活性均出现显著增加，其中1 mg/L为显著变化剂量点。根据实验结果，选取0.1、100 mg/L为主要考察剂量，利用DCFH－DA荧光探针测定斑马鱼仔鱼体内的活性氧含量，结果见图5。与对照组相比，药物处理后斑马鱼体内ROS含量增加，但两种药物对该指标的影响差异较小。综合以上结果，FF对斑马鱼体内氧化应激的影响大于FFA。

图4 氟苯尼考和氟苯尼考胺对斑马鱼的CAT、MDA和GSH指标的影响

图5 氟苯尼考和氟苯尼考胺对斑马鱼体内ROS含量的影响（图像放大倍数为32倍）

（三）细胞凋亡为进一步研究氧化还原系统被破坏对斑马鱼胚胎细胞凋亡的影响，采用AO染色和JC－1染色开展凋亡染色成像实验，结果发现FF和FFA均会诱导斑马鱼体内产生不同程度的细胞凋亡。从线粒体膜电位的染色结果来看，暴露后96 h绿色荧光转变增加，且FF处理下发生转变的程度大于FFA处理。但在暴露后120 h，被染色的部位主要集中在肠道，这可能与受精后第5天斑马鱼进入开口期有关（见图6）。AO染色结果与JC－1染色结果一致，其结果表明，药物处理组会诱导斑马鱼体内发生凋亡，且主要集中于心脏和脑部（见图7）。综上，FF及FFA均会诱导斑马鱼体内发生不同程度的细胞凋亡。

图6 氟苯尼考和氟苯尼考胺对斑马鱼线粒体膜电位的影响（图像放大倍数为32倍）

图7 不同暴露时间点的斑马鱼胚胎AO染色图像（图像放大倍数为50倍）

三、讨论

氧化应激是机体一旦接触外源性化合物后，所引起的氧化/抗氧化系统失衡现象。ROS含量的增加，会引起生物大分子损伤（如蛋白质、脂质和脱氧核酸），甚至是更为严重的损害[28]。根据文献报道，氟苯尼考增加了肉鸡血清和肝脏组织中的MDA的含量，但降低了GSH、超氧化物歧化酶（SOD）和CAT的活性[29]。本文发现，经过氟苯尼考和氟苯尼考胺处理后，斑马鱼体内出现了ROS含量的积累。

抗氧化酶，如GSH和CAT等，在保护机体免受ROS所引起的损害方面发挥着重要的作用[30]。本实验中GSH的活性增加，CAT的活性呈现低剂量诱导而高剂量抑制的变化趋势，说明斑马鱼体内的抗氧化系统被充分调动，并且FFA所引起的抗氧化反应水平高于FF。另外，FF会引起MDA含量的显著增加，说明其诱导的氧化应激引发了脂质损伤，而代谢物FFA诱导的氧化应激损伤是可逆的。上述结果与现有的文献一致，比如氟苯尼考会抑制三疣梭子蟹的解毒功能[31]，引起欧洲鲈鱼体内的SOD、CAT活性和MDA含量升高[32]。

斑马鱼体内发生氧化应激后，会诱发进一步的损害。这些损害反应可以通过形态学观察得到，如利用斑马鱼的死亡率、形态学异常和运动行为等指标可以反映药物暴露所产生的毒性效应[33]。根据形态学观察结果，FF和FFA对斑马鱼胚胎的孵化率和仔鱼的心率产生了不同程度的影响。与FFA处理相比，FF处理暴露后48 h，斑马鱼胚胎的孵化率出现显著降低的剂量点更低，暴露后72 h和96 h所引起的心率增加的幅度更大。对于畸形情况，FFA会引起斑马鱼体长变短，FF则对鱼鳔缺失有影响。上述形态学变化可能是由氧化应激引起的。有研究表明，氟苯尼考可通过抑制Nrf2－ARE途径中相关因子的表达来促进雏鸡的氧化应激反应[34]。Nrf2信号通路作为一种应激补偿机制被激活[35]，而该抗氧化通路Nrf2－Keap1的紊乱，会导致斑马鱼胚胎存活率下降[36]。

氧化应激与细胞凋亡之间存在着密不可分的联系。机体内活性氧的积累和对抗氧化剂的抑制，加剧了氧化应激，从而诱导细胞凋亡的产生[37]。AO染色结果表明，FF和FFA均会诱导凋亡的产生，主要集中于心脏和脑部。这两个部位是斑马鱼体内毒性发挥作用的重要场所。在调控细胞凋亡的过程中，线粒体发挥着重要的作用。线粒体为斑马鱼的胚胎发育提供能量，线粒体功能受损会造成能量代谢紊乱、细胞凋亡和氧化损伤[38～39]。本文JC－1染色的结果表明，两种化合物均降低了斑马鱼的线粒体膜电位，引发了线粒体功能损伤。这与之前报道的氟苯尼考对细胞线粒体功能的影响结果一致[40]。

FF和FFA具有结构相似性，含氟取代基的化合物更易在生物体内积累，在较低剂量水平下呈现出较高的生物积累潜力[41]。但由于氨基基团的存在，FFA的性质有所不同。根据文献报道，氟苯尼考在鲫鱼肝脏组织中的残留时间长于氟苯尼考胺，该现象与化合物需要被吸收和分布到各个组织系统中才能生物转化为代谢物有关[42]，这说明氟苯尼考胺更容易在生物体内发生代谢和生物转化。化学结构上的区别是导致氟苯尼考及其主要代谢物氟苯尼考胺毒性差异的重要原因。

四、结论

本文从表型指标和氧化应激的角度，明确了氟苯尼考及其主要代谢物氟苯尼考胺对斑马鱼胚胎发育的影响差异。发现前者主要影响胚胎鱼鳔发育，后者则会导致体长变短，二者均会破坏胚胎体内的抗氧化系统，并诱导产生细胞凋亡，且主要集中于心脏和脑部，总体上母体毒性大于代谢物。相关结果为深入评估氟苯尼考及其代谢物的毒性风险、解析毒性作用机理机制奠定了重要基础。