精神分裂症患者肠道菌群多态性与代谢产物的关系*

余卓恒，宋文刚，梁静文

1.广东省深圳市龙岗中心医院检验科，广东深圳 518116；2.北华大学医学部，吉林吉林 132000

精神分裂症是困扰现代人类的重大慢性精神疾病之一，主要在青春期发作，持续终生。它干扰了患者多方面的生活，其复杂的病因和发病机制使大部分患者的临床疗效并不明显，同时也给社会和家庭造成严重的负担[1-2]。近年研究发现，肠道菌群失调是精神类疾病发病的重要影响因素[3]，肠道微生物可通过微生物-肠-脑轴影响神经递质的分泌，从而影响神经发育、认知和行为，而且通过神经内分泌可调节多种神经递质参与精神疾病的发生和发展[4]。目前，国内外关于精神分裂症与肠道菌群方面的研究并不多。本研究拟收集精神分裂症患者和体检健康者的粪便标本，进行16S rRNA高通量测序，并采用液相色谱-质谱(LC-MC)非靶向代谢组学方法检测精神分裂症患者和体检健康者粪便标本代谢产物，分析精神分裂症患者肠道菌群结构及其代谢产物变化，寻找肠道菌群改变影响精神分裂症患者代谢产物的相关机制，并寻找特征性指标协助临床诊断精神分裂症。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2020年5-11月在深圳市龙岗中心医院收治住院的21例精神分裂症患者的粪便标本作为精神分裂症组，其中男11例，女10例；年龄21～71岁，平均(44.48±5.39)岁。精神分裂症患者纳入标准：(1)符合精神分裂症相关诊断标准，由两名精神科医生(至少1名医生为副主任医师以上职称)诊断一致；(2)患者疾病史均在1年以上，服用药物种类相对一致且病情相对稳定。排除标准：(1)患者合并有糖尿病、甲状腺疾病、高血压、心脏病等其他可能影响肠道菌群稳定性的疾病；(2)近3个月内有腹泻症状者；(3)近3个月内使用过抗菌药物或益生菌类药物治疗者；(4)妊娠、哺乳期或月经期女性。选择同期在该院进行体检的21例体检健康者的粪便标本作为健康对照组，其中男11例，女10例，年龄23～68岁，平均(43.52±4.27)岁。纳入标准：(1)由1名精神科医师单独进行访谈并排除精神类疾病；(2)无精神病家族史；(3)未服用与精神病相关的任何药物；(4)年龄、性别分别与患者匹配。健康对照组的排除标准同精神分裂症组。

1.2方法 本研究采用16S rRNA高通量测序检测精神分裂症组和健康对照组的肠道菌群差异，并采用LC-MC非靶向代谢组学方法检测精神分裂症组和健康对照组其中17例粪便标本的代谢产物，分析精神分裂症患者肠道菌群结构及其代谢产物变化。所取得的粪便标本均在完成留样后2 h内采用无菌小离心管进行分装，并于-70 ℃低温冰箱冷冻保存。

1.2.1Alpha多样性分析 选择Alpha多样性指数对标本中的菌群丰度和多样性进行分析，分别使用Shannon指数评估标本的菌群多样性和chao1指数评估菌群丰度(物种的种类数量)，将得到的2个指数利用Wilcox Test统计方法分析精神分裂症组和健康对照组间的Alpha多样性指数差异。

1.2.2Beta多样性分析 本研究同时选择Weighted Unifrac距离，Unweighted Unifrac距离及Bray Curtis距离这3个距离模型作为Beta多样性距离的参考指标，评估不同样品及分组间的微生物群落结构差异，采用无度量多维标定法统计分析。

1.2.3肠道菌群结构差异 选取在属分类相对水平丰度排名前20的物种，分析各标本和各分组在属水平上的相对分布情况。采用LEFSe方法分析组间可操作分类单元(OUT)差异，选择LDA值>2作为筛选标准，即具有统计学意义的Biomakers特征微生物。

1.2.4非靶向代谢组学分析 将所有代谢物用KEGG数据库br08001进行注释，得到代谢物所扮演的生物学角色，然后统计每个生物学角色的百分比，绘制百分比堆积柱形图。

1.3统计学处理 采用16S rRNA测序得到全部原始序列进行质量控制、去噪、拼接、去嵌合体，形成OUT，即特征序列。采用LEFSe(基于物种相对丰度)和DESeq2(基于物种比例)进行标本的物种组间差异性分析；采用Wilcox Test统计方法对Alpha多样性进行组间差异性分析；采用PERMANOVA统计方法对Beta多样性进行组间差异性分析。测序分析流程基于qiime2及R语言数据包，以P<0.05为差异有统计学意义。

LC-MC非靶向代谢组实验数据先标准化处理使得所有的代谢物水平的中位数和上下四分位点基本处于同一水平；采用log转化使得代谢物水平分布接近正态分布；采用正交偏最小二乘别分析(OPLS-DA)模型和双样本t检验进行组间差异分析。所有分析流程基于R语言数据包，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1精神分裂症组与健康对照组粪便标本肠道微生物多样性分析

2.1.1Alpha多样性分析 结果显示，两组间的Alpha多样性差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

2.1.2Beta多样性分析 Beta多样性分析结果显示，标本分布在组间和组内间有差异。结合PERMANOVA统计方法再次进行分析所得的Bray Curtis Distance、Weighted Unifrac和Unweighted Unifrac距离的P均<0.05，即两组间的Beta多样性有明显差异，组间菌群结构有明显差异，见图2～4。

注：A为Shannon指数分析结果图；B为chao指数分析结果图。图1 Alpha多样性分析结果图

图2 Bray Curtis距离分析图

图4 Unweighted Unifrac距离矩阵分析图

2.2精神分裂症组与健康对照组在属水平上肠道菌群结构差异 根据属水平上物种的相对分布情况显示各标本和各分组间均有差异，见图5。筛选到19个属水平上的差异性大的物种，再结合DESeq2方法统计属水平上物种的P<0.05的菌属，其中上调菌属有12个：安德克菌属、消化链球菌属、梭菌属、肠球菌属、锥形杆菌属、普雷沃菌属、梭杆菌属、醋酸杆菌属、疣微菌属、瘤胃球菌属、丁酸弧菌属、优杆菌；下调的菌属有7个：粪杆菌属、嗜血菌属、毛螺菌属、德克斯菌属、假丁酸弧菌属、SMB53、氨基酸球菌属。

图5 两组在属水平上的肠道菌群结构差异

2.3LC-MC非靶向代谢组学分析结果

2.3.1两组代谢物组成的差异分析 结果显示，两组间的代谢物的组成存在不同程度的差异。见图6。

图6 精神分裂症组和健康对照组粪便标本中代谢物组成的差异分析

2.3.2两组粪便标本的特征代谢物筛选 本研究在OPLS-DA的置换检验中，使用Q2作为检验统计量，使用置换的方法求得Q2的随机分布，并计算其P值以求证明其预测能力，P均<0.01，说明该预测模型能区分两组之间代谢物的差异，见图7。本研究利用OPLS-DA模型的判别分析寻找VIP(重要性)最大的代谢物，选择 VIP>1并且经 FDR校正后的P<0.05的代谢物，本研究找到了7个代谢物分别为：异丙肾上腺素、R-3-羟基肉豆蔻酸、13-二甲基尿酸、137-三甲基尿酸、十一酸、鹅去氧胆酸、邻氨基苯甲酸。最后结合OPL-DA模型筛选VIP最大的代谢物和单变量分析，发现异丙肾上腺素、R-3-羟基肉豆蔻酸、十一酸、鹅去氧胆酸、邻氨基苯甲酸在精神分裂症组中是上调的，而13-二甲基尿酸、137-三甲基尿酸在精神分裂症组中是下调的。

注：A为阳离子模式的Q2分布图；B为阴离子模式的Q2分布图。图7 两组在OPLS-DA检验中Q2分布图

2.3.3多组学关联的相关性分析 本研究对属水平上的微生物及负离子的代谢物同时进行双样本t检验，得到相关的差异物种及差异代谢物(P<0.05)，根据本研究找到的特征菌属和特征代谢物进行关联性热图分析发现，精神分裂症患者中可能与脂肪酸代谢途径正向调节相关的菌属有梭菌属、消化链球菌属、梭杆菌属、肠球菌属，负向调节相关的菌属有假丁酸弧菌属、粪杆菌属；与鹅去氧胆酸正向调节相关的菌属有梭菌属、消化链球菌属、肠球菌属、优杆菌属，负向调节相关的菌属有粪杆菌属、假丁酸弧菌属、嗜血菌属、毛螺旋菌属；与免疫炎症机制正向调节相关的菌属有肠球菌属、消化链球菌、梭杆菌属、疣微菌属、优杆菌属，负向调节相关的有毛螺旋菌属、氨基酸球菌属。

3 讨 论

本研究收集21例精神分裂症患者和21例体检健康者的粪便进行16S rRNA测序，并采用LC-MC非靶向代谢组学检测精神分裂症患者和体检健康者中的17例粪便标本的代谢产物。因考虑标本对菌群结构的影响因素较多，本研究对精神分裂症组和健康对照组的年龄跟性别进行一一配对。研究采用Alpha多样性分析发现精神分裂症组和健康对照组间微生物菌群数量没有明显的差异，可能因精神分裂症组经药物治疗后，导致菌群数量接近健康对照组菌群数量水平。但采用Beta多样性分析，患者肠道微生物构成有明显差异，差异有统计学意义的共有19个，而且还发现疣微菌和梭杆菌是从门水平到属水平在精神分裂症患者中显著富集。

在属水平上，与健康对照组比较，精神分裂症组7个菌属相对丰度降低，12个菌属相对丰度升高，其中2个属于典型的益生菌(毛螺菌属和粪杆菌)属水平较低。毛螺菌属能参与人体短链脂肪酸的代谢，而短链脂肪酸是肠上皮细胞能量的主要来源[5]，因此毛螺菌属水平降低可能会导致肠上皮细胞通透性改变，进而导致短链脂肪酸进入血液循环并通过血脑屏障直接影响中枢神经系统，诱发神经系统炎症并引发与精神分裂症相关的行为特征。

本研究发现精神分裂症组的普雷沃菌属、疣微菌属、瘤胃球菌属明显高于健康对照组，而嗜血杆菌和德克斯菌属则减少，与相关研究一致[3,6-8]。SCHWARZ等[7]还报道瘤胃球菌属水平增加与精神分裂症的阴性症状和认知缺陷的减少相关，乳酸菌的丰度在精神分裂症患者首发时增加，并且与症状的严重程度呈正相关，但是本研究中乳酸杆菌在精神分裂症组和健康对照组间的差异不明显，可能是因为本研究的精神分裂症组有药物使用情况。本研究发现精神分裂症组的肠道菌群组成确实发生了明显的变化，这些变化的菌群可能与精神分裂症的发生发展有一定的关联，有望为精神分裂症早期诊断及治疗提供一定的依据。

精神分裂症患者存在认知功能障碍，其大脑的认知功能进化与能量代谢相关[9]。肠道微生物不仅参与人体内肠道代谢，其产生的代谢产物也能影响机体不同的代谢途径，进而影响疾病的发生和发展。本研究发现137-三甲基尿酸、13-二甲基尿酸在精神分裂症组中是下调的，其中甲基尿酸为嘌呤类生物碱。一些嘌呤类生物碱能促进脂肪酸β氧化及增强氧化磷酸化，同时增强机体组织脂肪燃烧，达到降血脂的作用[10]。精神分裂症组肠道微生物代谢物甲基尿酸的下调可能致使脂肪代谢减少，进一步导致脂肪酸增加，这可能是精神分裂症组引起代谢产物饱和脂肪酸十一酸上调的原因。据本研究找到的特征菌属和特征代谢物进行关联性热图分析发现，精神分裂症患者中可能与脂肪酸代谢途径正向调节相关的菌属有梭菌属、消化链球菌属、梭杆菌属、肠球菌属，负向调节相关的菌属有假丁酸弧菌属、粪杆菌属。

本研究发现精神分裂症组的肠道菌群代谢产物鹅去氧胆酸水平较健康对照组升高，鹅去氧胆酸由肝脏合成，分泌到肠道，经细菌生物转化形成次级胆汁酸包括脱氧胆酸和胆石酸。胆汁酸信号通路核受体法尼酯X受体(FXR)与TakedaG蛋白偶联受体5已被鉴定为胰岛素抵抗、肥胖、脂质代谢和全身代谢过程的调节剂[11]，其中鹅去氧胆酸激活FXR的能力最强。有研究显示，长期使用氯氮平治疗可引起患者脂代谢异常，导致不可逆的肥胖[12]。本研究中精神分裂症患者均接受过氯氮平等精神分裂症常用的药物治疗，且鹅去氧胆酸水平较体检健康者升高，有可能激活FXR，引起脂质代谢异常。在特征菌属和特征代谢物的关联性热图中发现，与鹅去氧胆酸正向调节相关的菌属有梭菌属、消化链球菌属、肠球菌属、优杆菌属，负向调节相关的菌属有粪杆菌属、假丁酸弧菌属、嗜血菌属、毛螺旋菌属。

有研究表明，高饱和脂肪饮食增加革兰阴性菌的比例，进而增加内毒素血症[13]。同时，NGUYEN等[14]研究了不同膳食油处理对猪回肠组织体外内毒素转运的影响，发现鱼肝油和鱼油(不饱和脂肪)降低了肠道通透性，而椰子油(饱和脂肪)增加肠道通透性。脂筏可调节肠内毒素转运，饱和脂肪可稳定脂筏，使内毒素转运更充分，揭示饱和脂肪可能通过增加肠道渗透性，改变肠道菌群组成，从而导致代谢性内毒素血症[14]。另外脂质A可与巨噬细胞上的Toll样受体4(TLR4)结合引起机体的免疫和炎症反应[15]。R构型的3-羟基豆蔻酸是天然的脂质A的组成成分，而脂质A是内毒素的主要组成结构，本研究发现的特征菌属大部分为革兰阴性菌，这可能就是R-3-羟基肉豆蔻酸上调的原因；另外邻氨基苯甲酸是一种具有毒性的物质，对黏膜有刺激作用，这2个代谢物的上调可能通过增加肠道渗透性引发细菌移位和炎症反应。在特征菌属和特征代谢物的关联性热图中发现，与免疫炎症机制正向调节相关的菌属有肠球菌属、消化链球菌、梭杆菌属、疣微菌属、优杆菌属，负向调节相关的有毛螺旋菌属、氨基酸球菌属。

精神分裂症患者可通过酪氨酸代谢途径分解酪氨酸合成儿茶酚胺类代谢物，进而影响疾病的进程[16-17]。本研究发现异丙肾上腺素的在精神分裂症患者中是上调的，也符合这一论点。肾上腺素主要通过酪氨酸代谢产生，但是异丙肾上腺素不是天然存在的肾上腺素，异丙肾上腺素主要通过肝脏代谢并由肾脏进行排泄，而且半衰期短，本研究在肠道检测出有较高水平的异丙肾上腺素，这是否提示肠道菌群可以通过酪氨酸代谢合成异丙肾上腺素，这有待进一步研究验证。

本研究分析精神分裂症患者和体检健康者间的肠道微生物结构及其肠道微生物代谢产物的差异，为精神分裂症的临床诊断和治疗道路上提供一定证据。但也存在以下问题：患者样本量少、受粪便标本保存及运送条件等影响较大。本研究中患者入组时已接受药物治疗，无法分析治疗前的肠道微生物的结构组成，不能明确精神分裂症治疗常用药物对肠道菌群的影响。后续研究需扩大患者样本量，控制其他外在干扰因素进行纵向深入研究，纳入未经治疗的研究对象，研究用药前后患者肠道菌群变化情况。