上海地区NRAS基因突变检测室间质量评价分析*

黄中强，肖艳群，王雪亮，杨依绡，蒋玲丽，周 靖

上海市临床检验中心分子生物学室，上海 200126

神经母细胞瘤病毒癌基因RAS同源物(NRAS)基因是RAS基因家族的主要基因之一，属于细胞内信号传导蛋白类原癌基因。当NRAS基因发生突变时，会降低RAS蛋白水解三磷酸鸟苷转化为二磷酸鸟苷的能力，继而引起下游通路的改变，致使细胞产生恶性增殖[1-2]。使NRAS基因处于激活状态的突变主要位于第2、3、4外显子上，且多见于黑色素瘤、急性髓系白血病和结直肠癌[3]。临床研究发现NRAS基因突变的结直肠癌患者不能够从表皮生长因子受体(EGFR)治疗中获益[4]，因此在《中国结直肠癌诊疗规范(2020年版)》中再次推荐对患者进行NRAS基因突变检测，以指导肿瘤靶向用药[5]。当前NRAS基因突变检测在临床中已广泛开展，常用的检测方法有扩增阻滞突变系统(ARMS)、Sanger测序、高通量测序(NGS)等[6]。多项研究发现，不同实验室间EGFR、鼠类肉瘤病毒癌基因、鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌基因同源体B和磷脂酰肌醇激酶-3催化亚单位α基因突变检测结果的一致性较差[7-10]，但目前国内有关NRAS基因突变检测能力的评估报道较少。因此，本研究拟通过开展NRAS基因突变检测的室间质量评价(EQA)，以期发现临床实验室相关项目存在的问题，进一步改善和提高其检测质量。

1 材料与方法

1.1标本制备 标本购自菁良基因科技(深圳)有限公司，由具有特定NRAS基因突变型(G12D、G12V、G13D、Q61K、K177N、A146T)的标本和野生型细胞混合后，经甲醛溶液固定、石蜡包埋(FFPE)制备，突变型标本的突变比例约为50%。每支标本管中放有1卷蜡片，组织厚度在15～20 μm，于2～8 ℃冰箱保存。

1.2仪器与试剂 ABI7500荧光定量PCR仪、NanoDrop One超微量紫外分光光度计购自美国Thermo Fisher Scientific公司；人类NRAS基因突变检测试剂盒购自厦门艾德生物医药科技股份有限公司；FFPE DNA核酸提取试剂盒购自德国Qiagen公司。

1.3标本分析

1.3.1标本验证 使用NRAS基因突变核酸检测试剂盒对EQA标本进行验证，确保标本含有预期NRAS基因型。

1.3.2均匀性与稳定性评价 参照《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》中关于均匀性和稳定性的评价要求[11]，每批EQA标本随机抽取某个突变型标本10支，使用NRAS基因突变检测试剂盒进行检测，完成均匀性评价；在参评实验室上报结果后的3 d内，随机抽取2～8 ℃冰箱保存的某个基因型EQA标本6支，使用NRAS基因突变检测试剂盒进行检测，完成同步稳定性评价。

1.4EQA的实施 于2019年5月和2020年5月向各参评实验室发放2次EQA标本盘，每套标本盘包含5支标本，其中突变型标本4支，野生型标本1支。为防止参评实验室串通数据，每套标本盘的标本进行随机编号。标本盘经冷链运输至各参评实验室，要求其在规定时间内用实验室常规检测系统检测，并在2周内将结果通过网络系统上报至上海市临床检验中心数据库。

1.5结果评价与分析 根据各实验室的回报结果计算各参评实验室得分，预期结果：野生型标本不被检测为突变型，突变型标本不被检测为野生型或其他突变型。回报结果与预期结果相符的得20分，不符的得0分，实验室结果≥80分为成绩合格，100分为优秀，否则为不合格。另外对检测结果进行统计分析，计算整体符合率、假阳性率和假阴性率。

2 结 果

2.1EQA标本结果验证 本实验室对不同NRAS基因突变型的FFPE标本进行核酸抽提，使用分光光度法测定其基因组 DNA水平，结果显示不同标本DNA提取量均>1 000 ng，可满足不同检测方法对标本的需要量。使用荧光PCR技术对所提取的核酸进行检测，结果证实不同标本含有预期NRAS基因型。见图1。

注：NEG为阴性对照。图1 NRAS EQA标本的RT-PCR扩增曲线图

2.2均匀性与稳定性评价 随机抽取10支G13D突变的FFPE标本进行均匀性检测，检测结果均为预期NRAS突变型，这表明EQA标本均匀性良好。在参评实验室上报结果后的3 d内对随机抽取的6支G13D突变的FFPE标本进行同步稳定性检测，结果均为预期NRAS突变型，表明标本具有良好的稳定性，可以满足EQA标本的要求。见图2、3。

注：POS为阳性对照；NEG为阴性对照。图2 NRAS EQA标本均匀性检测的RT-PCR扩增曲线图

注：POS为阳性对照；NEG为阴性对照。图3 NRAS EQA标本稳定性检测的RT-PCR扩增曲线图

2.3参评实验室整体回报情况 2019年和2020年参加NRAS基因突变检测EQA的实验室分别有37家和25家，在规定时间内收到的有效回报结果分别为26份和24份，有效回报率分别为70.27%、96.00%。2019年收到有效回报结果的参评实验室有26家，其中医院病理科11家，医学检验所15家；2020年收到有效回报结果的参评实验室有24家，其中病理科12家，医学检验所12家。在两次EQA中，参评实验室中最常用的方法为ARMS法，2019年占57.69%，2020年占66.67%，见表1。

2.4EQA结果评价 2019年和2020年两次EQA回报结果总体合格的实验室分别占84.62%、95.83%，结果完全正确的实验室分别占80.77%、79.17%，结果不合格的实验室分别占15.38%、4.17%。见表1。

表1 参评实验室检测方法和检测能力汇总[n(%)]

2019年和2020年两次EQA标本整体符合率分别为93.08%、93.33%，假阳性率分别为2.31%、1.67%，假阴性率分别为4.62%、5.00%。在2019年EQA中，有9支标本出现结果与预期结果不符的情况，其中G12D突变标本的符合率最低，为88.46%；在错误的结果中，6支标本检测结果为野生型，假阴性率为66.67%。在2020年EQA中，有8支标本出现与预期结果不符的情况，其中G13D突变标本的符合率最低，为87.50%；在错误的结果中，6支标本检测结果为野生型，假阴性率为75.00%。见表2。

表2 NRAS基因突变检测标本组成及符合率汇总[n(%)]

3 讨 论

近些年来，针对特定靶点的分子靶向药物越来越多地被应用于临床，极大地改善了肿瘤患者的预后，延长了生存时间[12]，但NRAS基因突变的肿瘤患者不能够从EGFR治疗中获益[4]，因此NRAS基因作为肿瘤靶向药物治疗的重要预测因子，准确地检测NRAS基因状态对于肿瘤患者的精准治疗及减少患者负担具有至关重要的意义[13-14]。为了全面了解本地区临床实验室NRAS基因突变检测项目的检测质量，本中心组织实施了EQA活动。

本研究2019年和2020年两次EQA结果显示，ARMS法是目前实验室最常用的检测方法，在两次EQA中分别占57.69%、66.67%，这与ARMS法的特异性强、灵敏度高和简单易操作的优点紧密相关[15]。两次EQA成绩合格的实验室分别占84.62%、95.83%，说明参评实验室的检测能力有所提高。

两次EQA中，假阴性结果为主要的错误类型，在两次EQA错误类型中分别占66.67%、75.00%。2017年英国分子遗传学会对英国RAS基因EQA的分析结果同样显示，NRAS基因突变检测的主要错误类型是假阴性结果[6]，而假阴性结果会导致肿瘤患者可能接受非必要治疗，这将对患者造成不良影响。本研究中出现假阴性结果的实验室使用的方法均为Sanger测序法和NGS法，需要指出的是，在2020年的EQA中，1家实验室出现了4例假阴性结果，其检测方法为Sanger测序法，所用试剂为实验室自配试剂，因此笔者推测导致假阴性结果的主要原因很可能与实验室自建方法(LDTs)未涉及相关基因位点或未经充分的性能确认有关[16]。另外，假阳性结果在两次EQA错误类型中分别占33.33%、25.00%，主要原因推测为人员操作不规范所致。因此，实验室应进一步强化人员操作培训并严格按照标准操作程序进行操作，对于使用LDTs的实验室，必须经过充分性能确认，避免假阳性和假阴性的情况发生。在对实验室回报结果进行分析时，未发现同一家实验室连续两次出现错误结果类型，这也表明实验室可通过加强质量管理工作提高其检测能力。

基于组织标本的分子病理检测EQA项目，最合适的检测标本为临床组织标本，但由于来源有限及组织的异质性等限制，细胞系和质粒DNA等不同类型的标本均可用于EQA计划[17]，其中细胞系制备的FFPE标本具有诸多优点，如易于大批量培养制备、可充分模拟临床标本、可对检测全过程进行监控等；此外，细胞系标本也可制备含有不同突变比例的FFPE标本。因此，本研究选用细胞系制备的含有NRAS基因主要突变位点的FFPE标本组织EQA活动。发放的标本除了均匀性和稳定性可满足EQA活动的要求外，也可同时对检测全过程进行监控，并且能最大限度地模拟临床组织标本用于EQA活动，但本研究未发放低突变频率和不同突变频率的标本，因此后续将深入探讨不同频率标本的影响。

综上所述，本研究结果表明本地区大部分实验室NRAS基因突变检测能力较好，但部分实验室检测能力尚需提高。此外，EQA活动可以持续改进实验室的检测质量，各实验室应加强质量管理工作，为临床精准用药和治疗提供更准确的指导和帮助。