宫颈癌组织中Zac1和LEF1的表达及临床意义*

刘 燕，朱 莉，田 冰

湖南省常德市妇幼保健院病理科，湖南常德 415000

宫颈癌是女性较为常见的肿瘤。全球范围内，宫颈癌每年约50万新发病例，每年死亡例数高达26万例[1]。临床上，宫颈癌的治疗以手术治疗为主，近年来，靶向药物和免疫检查抑制剂在临床的广泛使用，使肿瘤患者获得良好的治疗疗效及生存预后[2]。但在治疗过程中宫颈癌患者仍存在治疗抵抗或不敏感的现象[3]。深入研究宫颈癌的发病机制，对宫颈癌的诊断和治疗意义重大。多形性腺瘤基因样锌指因子1(Zac1)的编码基因位于人类6号染色体，该基因蛋白具有典型的锌指蛋白结构。Zac1在胚胎组织及女性子宫内膜组织中表达较高。肿瘤中Zac1主要发挥抑癌基因作用。研究表明，在肝癌[4]、结直肠癌[5]和肾细胞癌[6]等恶性肿瘤中Zac1表达下调，引起肿瘤细胞的无限增殖，抑制肿瘤细胞的凋亡，导致肿瘤患者的预后不良[5]。淋巴增强子结合因子1(LEF1)的编码基因位于4q25，该基因编码蛋白能结合并激活T细胞受体-α增强子，在细胞分化和毛囊形态发生中发挥作用[7]。LEF1在前列腺癌[8]、膀胱癌[9]等恶性肿瘤中表达上调，通过激活Wnt途径，促进肿瘤细胞发生上皮间质转化，促进肿瘤细胞侵袭及转移，导致肿瘤进展[10]。本研究通过检测宫颈癌中Zac1、LEF1的表达，分析两者与宫颈癌患者预后的关系，探讨Zac1、LEF1的临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2014年5月至2017年5月于本院诊治的83例宫颈癌患者的临床资料。纳入标准：(1)经病理学检查确诊为宫颈癌，由两位病理医师共同诊断；(2)无放化疗史；(3)宫颈癌患者一般状况良好，卡氏功能状态评分>70分。排除标准：(1)合并其他肿瘤；(2)合并宫颈良性病变；(3)合并重度脏器功能衰竭。宫颈癌患者年龄32～75岁，平均(47.1±5.3)岁；宫颈鳞癌60例，宫颈腺癌23例；高中分化50例，低分化33例；肿瘤FIGO分期：Ⅰ期55例，Ⅱ期28例；肌层浸润深度：浅肌层54例，深肌层29例；合并淋巴结转移18例，无淋巴结转移65例。所有宫颈癌患者均签署知情同意书，符合赫尔辛基宣言原则，经本院医学伦理委员会审核通过。所有宫颈癌患者出院后均予以随访，以门诊或电话方式进行，随访内容包括生存情况等。随访终止日期2021年5月，随访3～48个月，中位随访时间31.2个月。

1.2方法 实时荧光定量PCR(qPCR)检测，取术中黄豆粒大小宫颈癌组织和癌旁组织，癌旁组织距癌组织2 cm以上，经病理检查明确为正常宫颈组织，组织来源与宫颈癌来源一致。实验前称取50 mg组织，组织研钵研磨后，离心去除细胞碎片。用Trizol试剂提取组织中RNA，溶于DEPC水，用Narodrop2000检测RNA浓度。以RNA为模板，进行反转录，合成模板cDNA。然后以cDNA为模板，利用qPCR检测Zac1、LEF1 mRNA的表达。Zac1上游引物：5′-CCCAGAAATCTCACCAGTGTG-3′，Zac1下游引物：5′-GTGCCTCTTATAGCCCAGCAT-3′，LEF1上游引物:5′-TGCCAAATATGAATAACGACCCA-3′，LEF1下游引物:5′-GAGAAAAGTGCTCGTCACTGT-3′，内参GAPDH上游引物:5′-CTGGGCTATAAGAGGCACCTG-3′，内参GAPDH下游引物:3′-CTTTTCCTTGGTTCCGCTAGG-5′。qPCR引物的设计合成由北京天一辉远生物公司完成。qPCR反应条件为：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性40 s，62 ℃退火1 min，70 ℃延伸30 s，35个循环。qPCR反应总体系为10 μL，模板1 μL，前后引物各1 μL，SYBR premix Taq Ⅱ 5 μL，去离子水2 μL。每个标本实验重复3次。Zac1、LEF1的相对表达水平采用2-ΔΔCt方法计算，ΔCt= CT目的基因-CTGAPDH；ΔΔCt=CT样品-CT对照。

2 结 果

2.1宫颈癌组织和癌旁组织Zac1和LEF1相对表达水平比较 宫颈癌组织与癌旁组织中Zac1的相对表达水平分别为0.831±0.134、4.613±0.347，LEF1的相对表达水平分别为5.212±0.457、0.968±0.131。宫颈癌中Zac1的相对表达水平明显低于癌旁组织(t=92.629，P<0.001)，宫颈癌中LEF1的相对表达水平明显高于癌旁组织(t=81.330，P<0.001)。见图1。

图1 宫颈癌组织和癌旁组织中Zac1和LEF1相对表达水平比较

2.2Zac1与LEF1表达之间的相关性 结果表明Zac1与LEF1的表达呈负相关(r=-0.570，P<0.001)。见图2。

图2 Zac1与LEF1表达之间的相关性

2.3Zac1、LEF1表达与临床病理特征间的关系 宫颈癌中Zac1、LEF1的相对表达水平与肿瘤FIGO分期和淋巴结转移有关。肿瘤FIGO分期Ⅱ期癌组织中Zac1的表达明显低于FIGO分期Ⅰ期(P<0.05)；有淋巴结转移癌组织中Zac1的表达明显低于无淋巴结转移(P<0.05)。肿瘤FIGO分期Ⅱ期癌组织中LEF1的表达明显高于FIGO分期Ⅰ期(P<0.05)；有淋巴结转移癌组织中LEF1的表达明显高于无淋巴结转移(P<0.05)。见表1。

表1 Zac1、LEF1的表达与宫颈癌临床病理特征的关系

2.4Zac1、LEF1的表达与宫颈癌患者生存预后的关系 本研究中，对83例宫颈癌患者进行随访，随访过程中无失访，死亡22例，生存率为73.5%(61/83)。以Zac1相对表达水平的平均数0.831为临界值，分为低Zac1表达组42例，高Zac1组41例。低Zac1表达组生存率为61.9%(26/42)，明显低于高Zac1表达组的85.4%(35/41)，差异有统计学意义(χ2=5.801，HR=1.79，95%CI1.13～2.84，P=0.016)。以LEF1相对表达水平的平均数5.212为临界值，低LEF1表达组40例，高LEF1表达组43例。高LEF1表达组生存率为67.4%(29/43)，明显低于低LEF1表达组的80.0%(32/40)，差异有统计学意义(χ2=4.431，HR=1.66，95%CI1.04～2.63，P=0.035)。见图3。

2.5多因素COX回归分析宫颈癌患者生存预后的影响因素 以宫颈癌患者的生存情况为因变量(赋值1=死亡，0=存活)，纳入FIGO分期(赋值1=Ⅰ期，2=Ⅱ期)、淋巴结转移(赋值1=伴淋巴结转移，0=无淋巴结转移)、Zac1(赋值1=低表达，2=高表达)、LEF1(赋值1=高表达，2=低表达)为自变量。多因素Cox回归分析结果表明，Zac1低表达(HR=2.473，95%CI1.560～4.610)，LEF1高表达(HR=1.780，95%CI1.091～2.283)，FIOG分期Ⅱ期(HR=1.731，95%CI1.112～2.502)及淋巴结转移(HR=2.810，95%CI1.353～4.816)是宫颈癌患者生存预后的危险因素。见表2。

注：A为Zac1相对表达水平与宫颈癌患者生存预后的关系；B为LEF1相对表达水平与宫颈癌患者生存预后的关系。图3 Zac1、LEF1相对表达水平与宫颈癌患者生存预后的关系

表2 影响宫颈癌患者生存预后的危险因素

3 讨 论

我国是宫颈癌发病率较高的国家，每年发病率高达16.6/100 000，严重威胁我国女性的身体健康[11]。随着我国宫颈癌筛查的普及和人乳头瘤病毒疫苗的推广，使得早期预防宫颈癌成为可能。但对于转移性宫颈癌及复发性宫颈癌患者，传统的手术及放化疗疗效较差，5年生存率仅有60%[12]。因此，深入探讨宫颈癌发生的分子机制，寻找新的诊断治疗靶点，对于指导宫颈癌患者的个体化治疗，具有重要的意义。

Zac1由PLAGL1基因编码，是含有7个锌指结构的转录因子，在多种类型的胚胎组织和子宫内膜组织中高表达。功能上，Zac1作为转录因子与靶基因的启动子区域结合，调控靶基因的表达，在胚胎发育、细胞凋亡和细胞周期停滞中发挥重要调控功能[13]。例如，Zac1可以与核受体(如p53和组蛋白乙酰转移酶)结合并促进p53的转录活性，诱导细胞周期停滞和细胞凋亡[14]。因此，在肿瘤中Zac1是一种重要的肿瘤抑制因子。本研究宫颈癌患者中Zac1的相对表达水平降低。目前在肿瘤中调控Zac1表达的机制还不清楚。LE等[15]发现，Zac1受miR-125b的表达调控，肿瘤中miR-125b表达上调能够促进Zac1 mRNA的降解，抑制Zac1的表达。此外，Zac1的表达还受到表观遗传学修饰的调控，肿瘤中Zac1基因启动区域CpG岛处的高甲基化，能够明显抑制Zac1的表达[16]。进一步研究Zac1在宫颈癌中表达的临床意义发现，Zac1的低表达与宫颈癌较高的肿瘤FIGO分期及淋巴转移有关，提示Zac1的低表达促进宫颈癌的肿瘤进展。SU等[16]研究表明，肿瘤中Zac1的表达下调能够促进肿瘤细胞发生上皮间质转化，提高宫颈癌细胞的迁移及侵袭能力，促进肿瘤的转移。此外，肿瘤中Zac1的低表达导致其促进p53蛋白转录的能力降低，细胞周期阻滞能力丧失，肿瘤细胞过度增殖，致使肿瘤分期升高[14]。因此，Zac1表达的降低与肿瘤的发生和进展相关。本研究利用Kaplan-Meier生存分析亦证实Zac1低表达的宫颈癌患者生存预后较差，并且多因素COX比例风险模型亦证实Zac1低表达是宫颈癌患者生存预后的独立危险因素。因此，检测Zac1的表达是评估宫颈癌患者预后的新型生物标志物，针对Zac1的治疗可能是一种能够改善患者预后的治疗方案，值得深入研究。

LEF1属于高迁移率家族的成员，主要通过改变DNA螺旋结构参与基因表达的转录调控，在细胞的分化及发育过程中发挥重要的调控功能。LEF1在各种类型的癌症中异常表达，包括食管鳞状细胞癌、前列腺癌和肝细胞癌等，并通过促进肿瘤的增殖及转移，导致肿瘤进展，与肿瘤患者的不良预后有关[17]。本研究宫颈癌患者中LEF1的相对表达水平升高，分析其机制可能与肿瘤中Wnt信号通路的过度激活有关。Wnt/β-Catenin通路在许多癌症的致瘤特性中起着关键作用。研究表明，LEF1是Wnt/β-Catenin通路的下游调节因子，有利于维持肿瘤细胞干细胞特性、肿瘤细胞上皮间质转化，进而导致肿瘤侵袭转移的发生[18]。此外，本研究发现LEF1高表达与宫颈癌较高的肿瘤FIGO分期及淋巴结转移有关，提示宫颈癌中LEF1的高表达促进宫颈癌的进展。一方面，LEF1能够诱导肿瘤细胞上皮间质转化过程，致使E-钙黏素表达降低，而N-钙黏素表达升高，导致肿瘤细胞黏附能力降低，迁移能力增强，促进肿瘤转移。另一方面，WANG等[19]研究表明，LEF1能够通过激活癌基因HRAS的表达，激活ERK/MAPK信号通路，导致肿瘤细胞的过度增殖。因此，本研究证实，LEF1在宫颈癌中可能作为一种促癌基因，促进宫颈癌的肿瘤进展。本研究通过生存分析发现宫颈癌患者中LEF1高表达的患者生存预后较差，并且是宫颈癌患者生存预后的独立危险因素，表明检测宫颈癌癌组织中LEF1的表达对宫颈癌具有重要的预后价值。此外，针对LEF1的靶向治疗可作为宫颈癌治疗的潜在靶点。PARK等[20]报道，LEF1的抑制剂氯硝柳胺能够逆转肿瘤细胞的干性特性，对肿瘤起到治疗作用。

本研究采用Pearson相关分析发现宫颈癌中Zac1与LEF1的相对表达水平呈负相关。目前两者的关系尚不清楚，可能是两者在肿瘤进展过程中存在一定的协同作用。FREIHEN等[21]报道，宫颈癌中Zac1基因处于高度甲基化的状态导致Zac1的表达降低，进而诱导Wnt通路中的关键转录因子如Snail的表达上调，Snail激活下游分子LEF1的表达，诱导肿瘤细胞发生上皮间质转化，进而促进肿瘤进展。但两者之间的相互作用关系及在宫颈癌中的具体机制仍有待深入研究。

综上所述，宫颈癌中Zac1表达降低，LEF1表达升高，两者的表达与肿瘤FIGO分期、淋巴结转移有关，Zac1低表达、LEF1高表达、肿瘤FIGO分期Ⅱ期及淋巴结转移是宫颈癌患者生存预后的独立危险因素，检测宫颈癌癌组织中Zac1、LEF1的表达是判断宫颈癌患者预后的标志物。但两者的临床应用价值仍需多中心、大样本的深入研究。