自动化磁珠法标本制备联合液相色谱串联质谱检测人血清中25-羟基维生素D的性能评价

卢 山，董辉苒，任文华，苏 玉，李春艳，万极硕，吴 俊

北京积水潭医院检验科，北京 100035

维生素D作为人体必需的营养素，对人体钙和磷的正常代谢有直接影响。维生素D缺乏十分常见，因此维生素D水平的准确检测对多种钙代谢相关疾病的预防和治疗有着重要的意义。维生素D在血液循环中的主要形式以25-羟基维生素D[25-(OH)D]呈现，其半衰期最长，浓度最高，且最稳定，能反映人体的维生素D总量。25-(OH)D的主要形式为25-(OH)D2和25-(OH)D3，所以评价体内维生素D营养状况最为有效的指标是血清中25-(OH)D2和25-(OH)D3水平[1]。

近年来，维生素D的检测越来越受到人们的重视。国家在2015年发布了血清中25-(OH)D3检测的行业标准[2]。目前液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)有通用性强、特异度和灵敏度高的优势，可以同时检测25-(OH)D2和25-(OH)D3，是国际上维生素D检测的金标准[3-10]。然而在临床检测维生素D的过程中，LC-MS/MS存在的问题是前处理过程复杂。目前多数实验室是通过手工操作完成加样和取样步骤，临床操作人员需要较高的技能要求，因此容易出现人为失误导致检测结果不好。近年来，自动化磁珠法(MSPE)标本制备的出现有望将LC-MS/MS技术发展成为前处理和检测一体的全自动检测方法，受到临床的极大重视，该法前处理过程简单，可节省人力和时间成本。因此，本研究评估了使用MSPE进行标本前处理后25-(OH)D2和25-(OH)D3的检测结果，并与液液萃取法(LLE)和传统固相支撑液液萃取法(SLE)检测结果进行比较，以期为临床选择不同的标本处理方法提供帮助。

1 材料与方法

1.1材料来源 血清标本为当天临床检测剩余血清，选取避免溶血、乳糜、黄疸的120份临床血清标本分装后于-20 ℃冰箱保存待用。

1.2仪器与试剂 LC-MS/MS系统(美国AB SCIEX)；自动化磁珠法质谱标本前处理系统ZPTQ 32(北京梅斯质谱生物)；低速离心机(北京京立)；微孔板振荡器、氮吹仪(杭州奥盛仪器)；LLE的25-(OH)D测定试剂盒(江苏豪思生物)。SLE所用提取板为Cleanert SLE 96Wellplate(天津博纳艾杰尔)。MSPE的25-羟维生素D测定试剂盒(北京梅斯质谱生物)。

1.3方法

1.3.1LLE法标本处理过程 按照常规的LLE操作流程进行操作，首先将100 μL标本添加至小型离心管中，再在其中加入100 μL含内标的甲醇，然后添加600 μL乙酸乙酯，震荡后离心取400 μL上清液，氮吹后用100 μL初始流动相复溶。质控和标准品同步按操作处理。

1.3.2SLE法标本处理过程 SLE法按Cleanert SLE 96Wellplate使用要求进行操作，首先将100 μL标本加入预设的96孔处理板中的标本位置，再在其中加入同位素内标，然后每孔加入100 μL纯水稀释静置5 min，之后每孔采用1 200 μL正己烷淋洗，收集淋洗液氮气吹干，用100 μL初始流动相复溶。质控和标准品同步按操作处理。

1.3.3MSPE标本处理过程 按照试剂盒操作规程操作。首先将100 μL标本加入预设的96孔中的标本位置，再在其中加入同位素内标，之后将96孔板转移至梅斯ZPTQ 32仪器进行自动标本处理。质控和标本同步按操作处理。

1.3.4LC-MS/MS 色谱柱采用Kinetex 2.6 μm C18100A 30×2.1 mm规格，含0.1%甲酸的水溶液为流动相A，以含0.1%甲酸的甲醇为流动相B，采用梯度洗脱：0～<0.3 min，40%流动相A；0.3～<1.5 min，0%～<40%流动相A；1.5～2.5 min，0% 流动相A；2.5～3.5 min，40%流动相A,流速0.5 mL/min。采用正离子大气压化学电离离子化的多反应监测模式，25-(OH)D2和25-(OH)D3定量离子通道质荷比分别为395.2∶269.3和383.3∶365.3；定性离子通道质荷比分别为395.2∶337.2和383.3∶257.2；内标离子通道质荷比分别为398.2∶272.3和389.3∶371.3。离子源温度：500 ℃，离子源电压5 500 V，气帘气30，雾化气55，辅助气20。

1.4性能验证 性能验证过程参考《液相色谱-质谱临床应用建议》[11]和《液相色谱串联质谱临床检测方法的开发与验证》[12]指南。

1.4.1线性、定量限和检测限评价 以标准溶液浓度为X轴，标准品和内标峰面积的比值为Y轴，进行线性回归分析，经“1/X2”权重得回归方程。将样品待测物和内标的峰面积比代入标准曲线方程，计算标本中25-(OH)D2和25-(OH)D3水平，r>0.99。以信噪比≥3时的浓度设为检测限，以信噪比≥10时的浓度设为定量限，且连续10次测定的变异偏差<20%。

1.4.2精密度评价 混合血清标本，平均分为2份，其中1份作为低水平标本，另1份添加适量标准品混合物作为高水平标本，将2个水平标本混匀，分装至冻存管，置于-80 ℃保存。每天各取出1支，制备8个平行管，测定3批次，计算该方法的精密度。

1.4.3绝对回收率评估 取来源于不同患者的血清标本，每份不少于1 mL，震荡混匀备用。标本再分为空白对照和MSPE提取前加标准品[添加2个10 μL不同浓度标准品，25-(OH)D2为3/13 ng/mL，25-(OH)D3为5/30 ng/mL]和MSPE提取后加标准品[添加2个10 μL不同浓度标准品，25-(OH)D2为3/13 ng/mL；25-(OH)D3为6/30 ng/mL]，最终用水补齐复溶体积。比较磁珠提取前加标准品(去除空白本底)与MSPE提取后加标准品(去除空白本底)峰面积的差异。

1.4.4相对回收率和准确度评估 通过测定混合血清和混合血清添加25-(OH)D2和25-(OH)D3的2个水平混合标准品溶液各10 μL[加入标准品对应理论水平25-(OH)D2为3/13 ng/mL，25-(OH)D3为6/30 ng/mL]，每种处理各制备3个平行管，计算加样回收率及与预期浓度的偏差。

1.4.5基质效应评估 采用标本处理后加入法。取4份来源于不同个体的血清标本，每份标本分为3份，经过MSPE提取，其中1份加入水，1份加入10 μL标准品25-(OH)D2(3 ng/mL)，25-(OH)D3(6 ng/mL)，另1份加入10 μL标准品 25-(OH)D2(13 ng/mL)，25-(OH)D3(30 ng/mL)，3份均加入10 μL混合内标。标本中去除空白中的信号值后与溶剂中标准品峰面积(或峰面积内标比)进行比较，分析方法的基质效应。

1.4.6方法比对 收集临床检测剩余血清标本120例，各待测物浓度在检测范围内分布相对均匀，采用LLE、SLE和MSPE同时进行处理，然后采用相同LC-MS/MS方法进行检测，比较3种提取方法检测结果的一致性。

1.5统计学处理 采用MedCalc进行统计学分析和作图，采用Bland&Altaman作图比较3种方法的差异，以Passing &Bablok回归分析3种方法之间的相关性。

2 结 果

2.1血清标本经MSPE提取后的典型色谱峰图 25-(OH)D2和25-(OH)D3的出峰时间分别为1.90 min、1.86 min，两种待测物峰形对称，各成分分离良好，互不干扰，且与SLE方法提取后的检测结果比较，MSPE提取后未发现杂峰明显增多。

2.2MSPE提取25-(OH)D2和25-(OH)D3性能评价结果

2.2.1线性、定量限和检测限 25-(OH)D2和25-(OH)D3分别在1.0～36.0 ng/mL，2.5～90.0 ng/mL范围内相关性良好，r在各批次均>0.99。25-(OH)D2和25-(OH)D3检测限分别为0.15 ng/mL、0.15 ng/mL；定量限分别为0.4 ng/mL、0.9 ng/mL，对应变异系数分别为11.71%、7.96%。

2.2.2精密度 25-(OH)D2和25-(OH)D3批内重复精密度分别在5.3%～6.5%、5.1%～6.8%；实验室内总不精密度分别在7.3%～10.6%、6.1%～8.0%，见表1。

表1 MSPE提取LC-MS/MS测定25-(OH)D的结果

2.2.3绝对回收率 25-(OH)D2绝对回收率在27.7%～31.3%，25-(OH)D3绝对回收率在21.7%～34.3%。

2.2.4相对回收率和准确度 25-(OH)D2和25-(OH)D3相对回收率分别在97.0%～104.0%、96.5%～106.3%，百分偏差均在±15%以内，见表2。

表2 MSPE提取LC-MS/MS测定25-(OH)D的结果

2.2.5基质效应 25-(OH)D2和25-(OH)D3在大气压化学电离检测下几乎没有基质效应的抑制，甚至还有些基质增强的趋势，另外经过同位素内标校正后，相对基质效应均在100%左右，亦可抵消潜在的基质效应，见表3。

表3 MSPE提取LC-MS/MS检测25-(OH)D的基质效应(%)

2.2.6方法比对 LLE、SLE和MSPE这3种方法提取临床120例血清标本中25-(OH)D2和25-(OH)D3的结果比较，其中SLE和MSPE相关性均良好(r>0.99)，2种方法比较25-(OH)D相对百分偏差在±15%以内，LLE和MSPE相对来说结果偏差较大(r>0.98)，2种方法比较25-(OH)D相对百分偏差在±25%以内。见图1～4。

图1 MSPE和SLE结果的相关性

图2 MSPE和SLE的Bland&Altaman分析

图3 MSPE和LLE结果的相关性

图4 MSPE和LLE的Bland&Altaman分析

3 讨 论

目前免疫法和色谱法是检测血清中25-(OH)D常用的方法，免疫法中有放射免疫法、酶联免疫吸附试验、化学发光免疫测定法及电化学发光免疫测定法[13]，色谱法中包括高效液相色谱法和LC-MS/MS[9-12]。其中，免疫类方法的优点是初始投入成本低、高自动化、重现性好，然而特异度和灵敏度不高，不能准确测定25-(OH)D2水平，测试标本后期成本较高，回收率较差等是其不可避免的缺点；高效液相色谱法优点是分离效果好、速度快等，缺点是灵敏度不高、且不能很好的定性等；LC-MS/MS具有灵敏度高、特异度强、准确度高的特点，能同时监测25-(OH)D2和25-(OH)D3，缺点是对检测人员技术要求高，仪器成本高[14-15]。LC-MS/MS技术检测25-(OH)D已受到临床医生及检验人员的共同认可，然而复杂的前处理过程限制了LC-MS/MS在临床的广泛应用，MSPE技术的出现为LC-MS/MS技术的自动化进程带来了革命性的突破。

目前，LC-MS/MS方法进行检测前均需要进行标本前处理。目前常用的前处理方法主要有固相萃取、液液萃取(包括SLE)、蛋白沉淀及免疫捕获等。对于水平较低的25-(OH)D及激素类物质往往需要使用较为繁琐的前处理方法，对实验室仪器配置和操作人员要求较高，并且不利于实现完全自动化。

本研究中MSPE通过在磁珠表面进行化学基团修饰，待测物与磁珠表面键合相发生吸附解吸附，模拟固相萃取的过程，其不同于免疫试剂中抗体包被MSPE的原理。首先活化平衡磁珠，然后加入待测标本，经过充分混合后，待测物与磁珠互相吸附，之后通过不同极性强度的洗脱溶液对磁珠淋洗洗脱，以达到分离和纯化的目的。MSPE有别于传统固相萃取，通过磁珠的转移来实现目标待测物的分离，不仅过程简单，自动化程度高，MSPE和LC-MS/MS联合使用有望成为一种前处理和检测分析一体的全自动检测方法。

综上所述，本研究验证了MSPE提取25-(OH)D的性能，MSPE和SLE这两种提取方法具有良好相关性，所得结果基本一致。MSPE有望在未来规模化应用于LC-MS/MS的自动化前处理过程，减少手工操作的误差，助力于临床应用。