三种磁珠法提取脱落细胞DNA的比较

王华荣，廖勤，吴世青

（1.沧州市公安局刑警支队，河北沧州 061000；2.唐山市公安局刑警支队，河北唐山 063000）

三种磁珠法提取脱落细胞DNA的比较

王华荣1，廖勤2，吴世青1

（1.沧州市公安局刑警支队，河北沧州 061000；2.唐山市公安局刑警支队，河北唐山 063000）

法医遗传学；DNA；提取法；磁珠法；脱落细胞

法医DNA鉴定中的脱落细胞检材是指含有人体皮肤黏膜脱落上皮细胞的检材，是当前刑事案件现场最有可能提取到的生物物证。目前关于脱落细胞提取纯化方法对比的报道[1-3]较多，但相同提取方法效果横向比较的研究较少。本研究对IQ磁珠、M48磁珠、PrepFiler磁珠三种常见的磁珠法提取脱落细胞DNA的检验效果进行比较，为法庭科学实践提供参考依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

50例脱落细胞类检材均取自本实验室2013—2015年检案积累，包括10枚烟蒂、10个饮料瓶、10件衣物（含手套、帽子）、10枚汗液指纹胶带及10例作案工具（手柄）。

1.2 方法

1.2.1 前处理

烟蒂及胶带上指纹采取剪取法，饮料瓶及作案工具采取擦拭法［4N6FLOQSwabsTM植绒拭子[4]（美国AB公司）］，衣物采取吸取法［生物脱落细胞提取仪[5]（北京贝斯湃生物技术有限责任公司）］。每份样本平均分配至3个微量离心管中备检。

1.2.2 DNA提取

IQ磁珠法：使用Maxwell®16自动纯化仪（美国Promega公司）按照仪器及IQ磁珠试剂盒（美国Promega公司）相关说明进行DNA抽提。

M48磁珠法：采用MagAttract M48 DNA Manual试剂盒（德国QIAGEN公司），按照公安部物证鉴定中心IFSC-02-02-05-2010《M48手工提取方法》进行DNA抽提。

PrepFiler磁珠法按照PrepFiler®BTA Forensic DNA Extraction试剂盒（美国AB公司）操作说明书进行DNA抽提。

1.2.3 DNA扩增、检测及分析

采用AmpFlSTR®Identifiler®Plus试剂盒（美国AB公司）10μL体系（包括缓冲液4μL，超纯水3μL，引物2 μL和模板DNA 1 μL），在9700型PCR扩增仪（美国AB公司）上按试剂盒说明书进行扩增。扩增产物用3130xl型遗传分析仪（美国AB公司）进行检测，GeneMapper ID v3.2软件分析结果。

磁珠提取法检验成功的评价标准：样本所有基因座均能正确分型，获得的谱峰峰高大于300相对荧光单位（RFU），杂合子两个峰高比例在70%以上[6]，无或少杂峰等干扰因素。

1.3 统计学分析

应用SPSS 19.0软件进行多组样本间的非参数检验和组间的两两比较，采用Kruskal-Wallis检验比较各组间的差异，检验水准α=0.05。

2 结果与讨论

表1 三种磁珠法提取五类检材检验的成功结果［n=10，例（%）］

2.1 结果

2.1.1 检验成功率

五类检材三种磁珠法提取检验获得成功结果情况见表1。对磁珠法、检材类型的不同检验成功率进行交互比较，发现差异均具有统计学意义（P＜0.05）。三种常见磁珠法脱落细胞检验成功率：PrepFiler磁珠法［45例（90%）］＞M48磁珠法［43例（86%）］＞IQ磁珠法［26例（52%）］。五类检材脱落细胞检验成功率：烟蒂［30例（100%）］＞衣物［26例（87%）］＞饮料瓶［24例（80%）］＞作案工具［18例（60%）］＞汗液指纹［16例（53%）］。

2.1.2 图谱均衡性及峰高

五类检材采用三种磁珠法提取检验获得成功结果的峰高均值和杂合子均衡性见表2。PrepFiler磁珠法与M48磁珠法的峰高及均衡性差异不明显，但均好于IQ磁珠法。对PrepFiler磁珠法、M48磁珠法与IQ磁珠法的峰高进行同一样本对比，发现三种方法均检验成功的样本中有21例（81%）在PrepFiler磁珠法与M48磁珠法的峰高为IQ磁珠法的1.5～2.5倍。本研究同时发现，检测得到的峰高均值越高，杂合子均衡性越好。

表2 三种磁珠法提取五类检材获得的峰高均值和杂合子均衡性（n=10）

3 讨论

三种磁珠法均利用细胞裂解液和蛋白酶促使细胞膜、核膜破裂释放DNA，通过磁珠作为载体在相关试剂盒试剂制造的环境下结合DNA，利用磁力架（棒）富集磁珠，并洗涤、纯化去除干扰杂质后，将DNA释放于体积相对较少、DNA模板浓度较高的洗脱液中。此过程起到提取、纯化、富集的作用，因此磁珠法对于污染重、微量的脱落细胞DNA的提取具有较大优势。

本研究中，五种不同类型脱落细胞检材样本的检验除采用不同的磁珠提取方法外，余实验环节均保持完全一致，确保无其他可能的因素影响结果的准确性。结果显示，对于烟蒂检材因其含有的模板DNA量较大，三种磁珠法均能获得理想的效果；对于饮料瓶、衣物类检材其含有的模板DNA量或多或少，PrepFiler磁珠法与M48磁珠法获得的图谱峰高均值更大，检验成功率更高；对于汗液指纹、作案工具等接触类检材其含有的模板DNA量较少，PrepFiler磁珠法与M48磁珠法获得的检验成功率更高。以上结果均表明PrepFiler磁珠法与M48磁珠法对DNA具有更好的吸附或释放性能，相比IQ磁珠法更适合于脱落细胞中微量模板DNA的提取检验，在实际检案应用中更具优势。

[1]杨电，刘超，徐曲毅，等.DNA IQ磁珠法结合Maxwell® 16自动仪提取接触DNA[J].刑事技术，2011，（3）：3-5.

[2]徐程，丰蕾，杨帆，等.微量接触DNA的浓缩与回收[J].山西医科大学学报，2014，45（6）：532-535.

[3]骆继怀，陈晓军，孙红兵，等.接触性生物检材提取DNA方法的比较[J].兰州大学学报（医学版），2015，41（1）：18-22.

[4]徐海军，叶志鹏，徐姚力，等.植绒和棉签拭子对不同载体微量生物物证的提取研究[J].刑事技术，2015，（5）：373-375.

[5]陈殿宇，郝金萍，张忠祥，等.生物脱落细胞提取仪在案件检验中的应用[J].刑事技术，2008，（2）：58-59.

[6]巴华杰，林子清，刘亚楠，等.5种免提取试剂盒检验滤纸血痕结果的比较[J].中国法医学杂志，2013，28（1）：49-51.

（本文编辑：张素华）

更正声明

各位读者，2016年第5期《钝器致鼻部骨折95例法医学分析》一文，有一处笔误，现更正如下：第355页“3.5完善鉴定标准的思考和建议”中第一段第四行“上颌骨额突骨折合并鼻中隔骨折按《旧标准》……”，更正为“单纯鼻骨骨折（无明显移位）合并鼻中隔骨折在《旧标准》中并无明确规定，实践中存在争议”。特此声明。

《法医学杂志》编辑部

DF795.2

B

10.3969/j.issn.1004-5619.2016.06.018

1004-5619（2016）06-0459-02

2016-06-03）

王华荣（1966—），男，副主任法医师，主要从事法医病理学和法医物证学鉴定与研究；E-mail：wushiqing507＠sohu.com