滤纸法在三种温度条件下保存标准菌株应用初探

文德学，莫梢梢，吴 健，李 莹，王 丽，张 杰

黔西南州人民医院医学检验科，贵州兴义 562400

实验室质控工作需要保存各种标准(质控)菌株，而保证质控菌株的稳定是做好质控工作的前提条件。菌种保存的方法很多，根据不同的菌株或不同的实验要求，可选用不同的保存方法，常见的方法有传代培养保存法、液体石蜡覆盖保存法、冷冻保存法、冷冻干燥保存法等[1]。大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌等非苛养菌质控菌株生长条件要求不高，通常用斜面琼脂培养基和半固体琼脂培养基覆盖液状石蜡等方法均可很好保存[2-3]，但需要频繁移种以保证存活率，而反复传代又易导致细菌变异并造成菌种污染。在保存过程中，需使微生物的代谢处于相对静止状态，以在一定的时间内使其不发生变异又保持很好的活性。低温、干燥和隔绝空气是使细菌代谢能力降低的重要因素。本课题组前期曾应用滤纸法保存标准菌株，基本满足上述3个条件，保存效果也很好[4]。但是，温度条件对一些基层医院还是有一定的制约，尤其是-80 ℃医用冰箱在基层医院目前尚未完全普及，且菌种从-80 ℃复温至室温，对人员操作技术要求更高，温差较大对菌株也会产生一定的影响。本实验室在0 ℃条件下可保存非苛养类标准菌株至少3年，在-20 ℃、-80 ℃条件下可较长期(至少7年)保存非苛养类标准菌株。这可为基层医院微生物室在质控工作中对标准菌株的有效保存提供依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1标准菌株 大肠埃希氏菌(ATCC25922)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、粪肠球菌(ATCC29212)4种标准菌株购于国家卫生健康委员会临检中心。

1.1.2仪器与试剂 血平皿(安图公司)；营养肉汤培养基(杭州天合微生物试剂有限公司)；0 ℃、-20 ℃、-80 ℃冰箱(海尔公司)；二氧化碳培养箱(HF212)，全自动细菌鉴定及药敏分析系统(PhoenixM50)；配套的革兰阳性PMIC/ID-55(448911)、革兰阴性NMIC/ID-4(448505)鉴定药敏试验复合板。

1.2方法

1.2.1实验前准备 (1)自封袋：根据需要购买适宜大小的自封袋。(2)无菌EP管：将市售直径2 cm的EP管置于密闭的消毒盒内，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min备用。(3)无菌滤纸条制备：将市售滤纸用剪刀剪成约0.5 cm × 1.0 cm 滤纸条，置于带塞的小试管内，经121 ℃高压蒸汽灭菌20 min备用。(4)营养肉汤培养基配制：按照说明书配制成成品肉汤后，分装于有塞小试管，每管1 mL，经121 ℃高压蒸汽灭菌20 min后备用。

1.2.2标准菌株的保存 将标准菌株在血平皿上划线分离培养18～24 h，获取纯菌落，然后用无菌眼科镊夹取1张无菌滤纸条，根据菌落大小，粘取1到数个菌落(以粘菌面积不超过滤纸1/3，滤纸条尚未完全被水分浸湿为宜)，放入无菌EP管中，盖紧EP管盖。根据需要，一次可制备数10管，将1～2条无菌滤纸条装一个EP管，贴上标签，标签上注明菌种名称和保存日期，再置于自封袋内，排尽袋内空气封严袋口，分别放入0 ℃、-20 ℃、-80 ℃冰箱保存。

1.2.3标准菌株的生物学性状观察和检测 将上述方法保存的4种标准菌株大肠埃希菌(ATCC25922)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、粪肠球菌(ATCC29212)在保存了1、2、3、7年后，取出上述各种菌种的一个EP管，直接置于室温环境平衡5～10 min，无菌操作取出相应菌种滤纸条，放入无菌营养肉汤管中复融5～10 min，轻轻振摇混匀后取一环营养肉汤培养基转种在血平皿上，置于35 ℃二氧化碳培养箱培养18～24 h，观察菌株的存活情况、菌落形态特征等有无变化。用PhoenixM50全自动细菌鉴定及药敏分析系统进行鉴定和药敏试验，比较标准菌株的基本生物学性状和药敏试验结果变化情况。

2 结 果

2.1保存于0 ℃的4种标准菌株 保存于2014年的大肠埃希菌(ATCC25922)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、粪肠球菌(ATCC29212)，在保存1年(2015年)、2年(2016年)、3年(2017年)时，用营养肉汤复融后分别移种到血平皿培养基上，置于35 ℃二氧化碳培养箱培养18～24 h，观察4种标准菌株均生长良好，存活率为100%，菌落形态特征没有明显改变，用PhoenixM50全自动细菌鉴定及药敏分析系统进行鉴定和药敏试验，4种菌株相应的基本生物学性状无改变，仪器鉴定菌种符合率为100%，药敏试验结果无明显变化。见表1、2。

表1 0 ℃保存的革兰阴性标准菌株药敏试验结果[最低抑菌浓度(MIC)法，μg/mL]

续表1 0 ℃保存的革兰阴性标准菌株药敏试验结果[最低抑菌浓度(MIC)法，μg/mL]

2.2保存于-20 ℃、-80 ℃冰箱的4种标准菌株 保存于2014年的4种标准菌株大肠埃希菌(ATCC 25922)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、粪肠球菌(ATCC29212)在保存1年(2015年)、2年(2016年)、3年(2017年)、7年(2021年)时用营养肉汤复苏分别移种到血平皿培养基上，置于35 ℃二氧化碳培养箱培养18～24 h，观察4种标准菌株均生长良好，存活率为100%，除金黄色葡萄球菌(ATCC25923)在-20 ℃、-80 ℃条件下保存到第7年(2021年)时，用接种环取菌落时出现轻微拉丝现象外，其余菌落形态特征没有明显改变，用PhoenixM50全自动细菌鉴定及药敏分析系统进行鉴定和药敏试验，4种菌株相应的基本生物学性状无改变，仪器鉴定菌种符合率为100%，药敏试验结果无明显变化，结果见表3、4、5、6。

表2 0 ℃保存的革兰阳性标准菌株药敏试验结果(MIC法，μg/mL)

表3 大肠埃希菌(ATCC25922)-20 ℃、-80 ℃保存4个时间段药敏试验结果(MIC法，μg/mL)

表4 铜绿假单胞菌(ATCC27853)-20 ℃、-80 ℃保存4个时间段药敏试验结果(MIC法，μg/mL)

表5 金黄色葡萄球菌(ATCC25923)-20 ℃、-80 ℃保存4个时间段药敏试验结果(MIC法，μg/mL)

表6 粪肠球菌(ATCC29212)-20 ℃、-80 ℃保存4个时间段药敏试验结果(MIC法，μg/mL)

续表6 粪肠球菌(ATCC29212)-20 ℃、-80 ℃保存4个时间段药敏试验结果(MIC法，μg/mL)

3 讨 论

菌种保存温度条件始终是重要的影响因素，4 ℃条件最容易获取，试验证明稳定性不好[5]，只能用于临时性保存，不宜用于质控菌株的长期保存。在-80 ℃条件下菌种保存的稳定性是得到肯定的，多数研究证明可保存5～10年[6-7]。但是-80 ℃医用冰箱在基层医院目前尚未完全普及，且菌种从-80 ℃复温至室温，对人员操作技术要求要高一些，温差较大对菌株也会产生一定的影响。在-20 ℃条件下，有报道滤纸片冷冻保存、灭菌牛奶保存、甘油保存可保存至少2年[8]，其他用多种方法保存多种菌种，一般保存1～5年[9-10]，根据不同菌种的特性，选择适宜的保存方法和相应的温度条件，才能获得理想的保存效果[11]。本研究用滤纸法保存的4种标准菌株大肠埃希菌(ATCC 25922)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、粪肠球菌(ATCC29212)，在0 ℃条件下保存3年或在-20 ℃、-80 ℃条件下保存7年，4种标准菌株均生长良好，存活率为100%，菌落形态特征没有明显改变，用PhoenixM50全自动细菌鉴定仪及配套鉴定药敏试验复合板进行鉴定和药敏试验，菌株相应的基本生物学性状无改变，仪器鉴定菌种符合率为100%，药敏试验无明显变化，少部分检测值有变化，但不排除仪器及试剂的原因。这提示该方法保存的标准菌株在 0 ℃条件下保存3年或在-20 ℃、-80 ℃条件下保存7年，菌株相应的基本生物学性状和药敏试验结果是稳定的。

本研究结果表明，滤纸保存法在0 ℃条件下保存非苛养菌标准菌株，3年内能满足实验室室内质控的要求，在-20 ℃、-80 ℃条件下保存非苛养菌标准菌株，7年内能满足实验室内质控的要求。基层医院微生物实验室，在扎实做好菌种保存管理工作的前提下[12]，用滤纸法选择在0 ℃、-20 ℃条件下保存非苛养菌标准菌株，是一个能满足实验室室内质控要求，操作简便，实用有效、安全的菌种保存方法。