慢性心力衰竭并发静脉血栓患者vWF活性与其基因多态性及民族的相关性研究*

宋金萍，马 晶，黄国虹

新疆维吾尔自治区人民医院临床检验中心，新疆乌鲁木齐 830001

慢性心力衰竭(CHF)是常见的心血管疾病，血栓栓塞是其严重的并发症，近年来，CHF发生率呈明显升高趋势，且常被心功能不全的临床表现所掩盖，易漏诊和误诊。CHF患者血管内皮细胞损伤，血管性血友病因子(vWF)水平明显升高，血液呈高凝状态，是静脉血栓形成的高危人群[1]。vWF 促进血小板的活化和聚集，充当凝血因子 Ⅷ(FⅧ) 载体，延长其半衰期，是血小板血栓和纤维素血栓形成的关键因素之一[2]。近期研究证实，vWF 过表达在心血管事件和动静脉血栓形成中具有重要意义[3-5]。遗传变异是静脉血栓最主要的原发性危险因素，凝血系统基因多态性是研究方向之一。目前与血栓性疾病相关的vWF基因多态性位点中rs7966230(-1793G/C)多态性在不同种族之间存在明显差异，且影响血浆vWF表达水平[6]。vWF 在动脉血栓中具有重要作用，但其在CHF患者并发静脉血栓中的研究国内外少见报道。鉴于 vWF 在心血管疾病和血栓形成中的重要作用，本研究探讨新疆维吾尔自治区CHF静脉血栓并发症患者vWF活性与其基因多态性及民族的相关性，分探讨新疆CHF 患者发生静脉血栓的机制，为 CHF 抗凝治疗提供重要依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2017年3月至2020年3月来本院就诊的42例CHF并发下肢静脉血栓患者作为CHF并发血栓组，其中男22例，女20例，年龄59～90岁，平均(72.47±12.88)岁，患者均为首次诊断出下肢静脉血栓。健康对照组来自同期本院104例体检健康者，男52例，女52例，年龄49～80 岁，平均(68.45±9.72)岁。

1.2仪器与试剂 核酸蛋白定量仪Nano-100(杭州奥康仪器有限公司)；电泳仪电源DYY-6C型(北京市六一仪器厂)；凝胶成像系统Tanon-2500(上海天能科技有限公司)；STAGO全自动凝血分析仪(法国STAGO公司)。ABI3730xl基因测序(美国ABI公司)。DNA提取试剂盒[小量全血基因组DNA提取试剂盒(溶液型)，北京君诺德试剂公司]；DNA Marker-B(上海生工试剂公司)；vWF和凝血因子Ⅷ活性测定试剂盒(法国STAGO公司)。

1.3方法 采集研究对象乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝外周全血2～3 mL，提取基因组DNA。采用琼脂糖凝胶电泳评估DNA质量，采用核酸蛋白定量仪测定DNA浓度。vWF基因rs7966230上游引物为5′-AAAGCGGACAGTGCGAGAC-3′，下游引物为5′-GGAGGAAGAGGAGCCTAAATG-3′，扩增产物片段约357 bp。PCR反应体系50 μL，反应条件：94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循环35次。PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上150 mV电泳25 min，并采用凝胶成像仪拍照。PCR产物使用ABI3730xl测序。使用BioEdit和DNAman软件分析实验结果，获得分型数据。采集研究对象枸橼酸钠抗凝外周全血2～3 mL，分离血浆，检测vWF和FⅧ活性。

2 结 果

2.1vWF基因扩增及测序结果 vWF基因12外显子rs7966230多态性位点位于6 126 547位碱基，其扩增产物大小为357 bp，见图1。测序结果显示，本研究检测到3种基因型GC、GG和CC型。

注：M为DNA Marker-B;泳道1～11为目的基因。

2.2两组vWF基因rs7966230多态性位点基因型和等位基因的分布情况 vWF基因rs7966230多态性位点检出GG、GC、CC 3种基因型，vWF基因rs7966230多态性位点基因型的分布符合Hardy-Weinberg定律(P>0.05)。与健康对照组比较，CHF并发血栓组vWF基因rs7966230多态性位点的基因型和等位基因的分布频率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组vWF基因rs7966230多态性位点基因型和等位基因分布情况[n(%)]

2.3不同民族vWF基因rs7966230多态性位点基因型分布情况 vWF rs7966230不同基因型在汉族和维吾尔族患者中的分布比例比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 不同民族vWF基因rs7966230多态性位点基因型分布情况(n)

2.4两组vWF基因rs7966230多态性位点不同基因型凝血因子差异比较 健康对照组rs7966230位点不同基因型vWF、FⅧ活性比较，差异无统计学意义(P>0.05)。CHF并发血栓组GC基因型vWF活性明显高于CC型，FⅧ活性明显高于GG型，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 vWF基因rs7966230位点不同基因型FⅧ和vWF活性比较

2.5不同民族vWF基因rs7966230位点不同基因型凝血因子差异比较 健康对照组和CHF并发血栓组各基因型不同民族vWF和FⅧ活性比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。

表4 不同民族vWF基因rs7966230位点不同基因型vWF和FⅧ活性比较

2.6CHF并发血栓患者vWF活性与其基因型及民族的相关性分析 Pearson相关性分析显示，vWF活性与rs7966230位点基因型(GC/CC)呈明显正相关(r=0.433，P=0.034)，而与民族无明显相关性(r=-0.017，P=0.913)。

3 讨 论

血浆vWF水平在普通人群中差异很大，并且这种变异与遗传和环境因素有关。有研究表明，vWF水平变异主要是由遗传变异决定的[7-8]。不同单核苷酸多态性基因型的人群vWF表达水平也不同，对疾病的易感性也不同[9-11]。本课题组前期的研究已证实，与健康人群相比，CHF患者常存在高凝状态，vWF和FⅧ活性均明显升高，下肢静脉血栓发生率高达20%，vWF基因调节区rs7966230(G/C)多态性位点在不同民族中的分布频率有明显差异，并与vWF的活性水平明显相关[11]。

维吾尔族是我国新疆维吾尔自治区主要的少数民族，具有特殊的遗传背景。傅玉等[12]有研究发现，我国裕固族rs7966230多态性位点基因型GG的分布远高于汉族。在本研究中，rs7955230多态性位点GG、GC和CC基因型分布在健康对照组和CHF并发血栓组中的差异无统计学意义(P>0.05)，同时在健康对照组和CHF并发血栓组不同民族中的分布差异无统计学意义(P>0.05)。其中，健康对照组汉族中GG、GC和CC基因型分别占46.94%、42.86%、10.20%，维吾尔族中GG、GC和CC基因型分别41.82%、49.09%、9.09%。这一研究结果与其他研究结果差异较大，尤其是CC基因型的分布频率远低于该研究中我国其他地区人群中的分布频率。但是在NCBI数据库中，该位点CC基因型在欧美人群中鲜见检出，GC基因型占多数，同时鲜见中国人群的相关研究数据。考虑可能因为本研究纳入人群的年龄和性别与已知文献报道不完全一致有关。

本研究结果显示，在CHF并发血栓患者中GC基因型患者vWF活性高于CC型，相应GC基因型FⅧ活性高于其他基因型(P<0.05)，但是相同基因型的不同民族患者的vWF和FⅧ活性差异无统计学意义(P>0.05)。这一结果提示CHF并发血栓患者可能存在影响rs7955230 位点GC基因型表达翻译的调控因素，进而影响vWF活性。vWF是FⅧ的载体蛋白，可延长FⅧ的半衰期，因而GC型FⅧ活性也相应高于其他基因型。相关性分析提示，CHF并发血栓患者血浆vWF活性与其基因多态性呈明显正相关，而与民族无明显相关性。

CHF并发血栓患者严重影响患者预后和生活质量，而在临床上被及时诊断的仅仅是实际血栓发生数量的极小部分。改变血液高凝状态、阻断和逆转血栓形成是治疗CHF并发血栓的关键环节。临床上对具有高危获得性危险因素的静脉血栓患者普遍采用大剂量抗凝疗法，但缺乏充分的用药依据，并可引起严重的不良反应[13-14]。积极探索以缓解血管内皮损伤为基础的预防CHF患者血栓栓塞发生的有效方法，将有助于揭示CHF患者发生静脉血栓的机制，为CHF抗凝治疗提供重要依据。

综上所述，新疆维吾尔自治区CHF并发静脉血栓患者vWF基因rs7955230多态性位点GC基因型与其活性密切相关，其可能受病理因素的调控，也有可能与其他基因位点存在连锁反应。该位点GC基因型vWF活性升高的具体机制值得进一步研究。由于CHF并发血栓病例相对难收集，因而样本量较小，后续研究还需扩大样本量进一步研究。