三元低共熔溶剂高效预处理提高杨木酶水解效率

2022-05-24赵天畅王杰侯海旭李海潮游婷婷许凤

林业工程学报 2022年3期

赵天畅，王杰，侯海旭，李海潮，游婷婷，许凤

(北京林业大学材料科学与技术学院，北京 100083)

木质纤维素是一种可再生、资源丰富且富有潜力的生物质资源，以其为原料开发生物乙醇等生物质能源，有利于实现“碳达峰，碳中和”[1]。有效的预处理可以打破木质纤维素抗降解屏障，增加纤维素酶对纤维素的可及度，显著提高生物乙醇的转化效率[2]。近年来，科研人员开发了多种预处理方法，如蒸汽爆破法、酸法、碱法、有机溶剂法、离子液体法及低共熔溶剂法等。其中，低共熔溶剂(DES)法是一种绿色的预处理方法。DES是由一定比例的氢键供体(HBD)和氢键受体(HBA)通过氢键作用形成熔点低于各组分的共晶混合物[3]，具有低挥发、不易燃、生物相容性、可降解性、价格低廉且可回收利用等优势，受到广泛关注。根据HBD的来源，DES可分为酸性、碱性和中性体系，其中以氯化胆碱和多元醇形成的中性体系具有流动性好、对设备腐蚀性小的优势，应用前景广阔。氯化胆碱(ChCl)是目前使用最广泛的生物基HBA，多元醇和羧酸是常用的HBD。Zhang等[4]采用以氯化胆碱和甘油(Gl)合成的中性DES-ChCl/Gl(物质的量比为2∶1)在90 ℃下预处理玉米芯24 h，纤维素残渣24 h酶解的葡萄糖得率达到96.4%。Chen等[5]采用氯化胆碱/乙二醇(EG)在130 ℃下处理柳枝稷30 min，酶解24 h葡萄糖得率仅为11%。针对上述中性DES预处理效率较低的问题，科研人员开发了部分可缩短预处理时间的多元醇基DES的复合体系。Wang等[6]向ChCl/Gl中加入氯化铁等路易斯酸催化剂，在120 ℃下预处理杂交狼尾草6 h，纤维素残渣24 h的酶水解效率增加至87%，酶水解时间延长至72 h，其效率可达99.5%。Guo等[7]研究结果显示，在ChCl/Gl中分别引入3种杂多酸，120 ℃条件下预处理奇岗芒3 h，奇岗芒24 h的酶水解效率升高至72%～92%，72 h酶水解效率超过90%。Chen等[5]在ChCl/EG体系中加入1%H2SO4，130 ℃下处理柳枝稷30 min，纤维素残渣24 h酶解葡萄糖得率超过90%。但DES与其他试剂的复合过程增加了操作步骤，使整个预处理过程更为烦琐复杂，能耗增加。Chen等[8]合成了氯化胆碱/乙二醇/对甲基苯磺酸三元低共熔溶剂，并将其用于预处理柳枝稷，经120 ℃条件下预处理6 min后，纤维素残渣36 h的酶解效率超过90%。由此可见，酸催化多元醇DES或现有的三元多元醇DES预处理仍无法有效缩短高葡萄糖转化率所需的酶解时间，进而降低转化效率。

对羟基苯磺酸是一种来源于木质素单体衍生物的双官能团有机酸，具有可回收、廉价等优点，已被用于生物质组分分离[9]。本研究以杨木为原料、以当前最常用的氯化胆碱为HBA，选用对羟基苯磺酸及乙二醇(或1,4-丁二醇)为HBD，合成两种新型三元低共熔溶剂，考察预处理时间和HBD种类对杨木的主要组分组成、结构特征，以及预处理残渣酶水解效率的影响，以期实现温和条件下的短时高效预处理和酶解。

1 材料与方法

1.1 试验材料

原料杨木，取自北京林业大学实验林场，杨木磨成0.25～0.38 mm的木粉后在60 ℃下烘干。用甲苯-无水乙醇(甲苯和无水乙醇体积比为2∶1)对杨木粉抽提6 h，而后在60 ℃下干燥至质量恒定，密封保存备用。纤维素酶CTec2，滤纸酶活为100 FPU/mL，购自丹麦Novozymes公司。氯化胆碱、乙二醇及1,4-丁二醇为分析纯，对羟基苯磺酸一水合物纯度为80%，所有药品均购自上海麦克林生化有限公司。

1.2 三元低共熔溶剂预处理

1.2.1 三元DES的制备

分别将氯化胆碱、乙二醇(或1，4-丁二醇)和对羟基苯磺酸一水合物按物质的量比1∶2∶0.1置于耐压瓶中，80 ℃加热直至形成澄清透明液体。然后将所得三元DES冷却，密封保存待用。合成的三元DES氯化胆碱/乙二醇/对羟基苯磺酸和氯化胆碱/1,4-丁二醇/对羟基苯磺酸分别标记为ChCl/EG/PSA和ChCl/BD/PSA。

1.2.2 原料预处理

将20 mL DES加入100 mL圆底烧瓶中，搅拌转速500 r/min，待升温至120 ℃，再向烧瓶中加入2.00 g杨木木粉，分别反应0.5，1.0和1.5 h。反应结束后立即冷却，并将60 mL 50%丙酮水溶液加入反应液中，常温搅拌2 h。将所得固液混合物分离，用50%丙酮水溶液洗涤固体残渣至洗脱液无色，继续用去离子水洗至中性，冷冻干燥。预处理残渣样品编号为ChCl/EG/PSA-0.5、ChCl/EG/PSA-1.0、ChCl/EG/PSA-1.5、ChCl/BD/PSA-0.5、ChCl/BD/PSA-1.0和ChCl/BD/PSA-1.5。

1.3 纤维素酶水解

分别准确称取0.200 0 g未处理和预处理的杨木样品分散于10 mL的乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH为4.8)，在50 ℃下水解24 h，纤维素酶用量为15 FPU/g[10-11]。为研究酶水解效率，定时(0.5，3，6，9，12及24 h)从水解液中取样200 μL，随后将样品灭活5 min。冷却后用0.22 μm针式过滤器过滤，所得滤液保存于超低温冰箱。

1.4 分析方法

1.4.1 Kamlet-Taft溶剂致显色化参数测试

将3种染料尼罗红、对硝基苯胺和N,N-二乙基-对硝基苯胺分别溶于无水甲醇中，制备成浓度为0.001 mol/L的母液。取0.5 mL母液于10 mL离心管中，在40 ℃下真空干燥48 h以挥发甲醇，而后将低共熔溶剂加入并混合均匀。在室温下采用UV-Vis分光光度计(UV-2600i，日本岛津公司)对混合液的吸收光谱进行测试。Kamlet-Taft溶剂致显色化参数的计算见公式(1)～(3)[12]。

π*=0.314×(27.52-νNEt2)

(1)

(2)

(3)

式中：α为氢键酸性；β为氢键碱性；π*为可极化性；λmax为所用染料的最大吸收波长；ν=1/(λmax×10-4)。

1.4.2 化学组成测定

采用美国可再生能源实验室(NREL)标准方法，NREL/TP-510-42618“Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass”，测定预处理前后杨木中纤维素、木聚糖及木质素的含量。

1.4.3 固体回收率

固体回收率计算见公式(4)：

(4)

式中：y为固体回收率，%；m1为回收物料质量，g；m2为初始物料质量，g。

1.4.4 单糖含量测定

葡萄糖及木糖含量均采用高效液相色谱仪(Agilent 1200)测定，Aminex HPX-87P分析柱(7.8 mm×300 mm，Bio-Rad)，进样量5 μL，流动相为0.005 mol/L H2SO4溶液，流速0.6 mL/min，柱温50 ℃。

1.4.5 红外光谱检测

预处理前后的杨木样品红外光谱用傅里叶红外光谱仪(TensorⅡ，德国布鲁克)进行采集，分析预处理前后杨木木粉的官能团信息。采用KBr压片法制样，称取DES预处理前后样品10 mg，按质量比1∶100加入KBr，混合均匀后充分研磨，在10 MPa下压片后进行红外分析，测试过程中，光谱信号采集范围为1 800～800 cm-1，分辨率为4 cm-1。

1.4.6 X-射线衍射检测

预处理前后的杨木样品结晶度及结晶结构采用X-射线衍射仪(D8 Advance，德国布鲁克)测定，布拉格角测定范围为5°～35°，步长0.03(°)/s。随后的样品相对结晶度(CrI)根据Segal提出的经验公式进行计算，见公式(5)。

(5)

式中：I002为002晶格的极大衍射强度；Iam为无定形区背景衍射的散射强度。

1.4.7 表面形貌观察

采用场发射扫描电镜(SU8010，日本日立公司)观察预处理前后杨木木粉的表面形貌。观察前先将样品固定在金属平台上，并进行喷金处理。扫描电压10 kV。

1.4.8 酶解效率测定

过滤后的酶解液采用高效液相色谱系统检测水解液中葡萄糖质量浓度。预处理物料酶解效率计算见公式(6)：

(6)

式中：yc为酶解效率，%；c1为酶水解所得的葡萄糖质量浓度，mg/mL；V1为酶解液的体积，mL；m0为酶解底物质量，g；ω为酶解底物纤维素质量分数，%。

2 结果与分析

2.1 三元DES氢键酸性、碱性及可极化性

采用溶剂化显色参数评估了ChCl/EG/PSA和ChCl/BD/PSA的α、β和π*的结果见表1。较高的α值表明DES具有较强的氢键给予能力，有利于破坏木质纤维原料中的醚键和酯键，增强预处理效果;较高的β值表明其具有更高的氢键接受能力，更有利于打破木质纤维的氢键网络结构，并可能脱除更多木质素和半纤维素，进而提高预处理效果。由表1可知，ChCl/BD/PSA的α和π*值与ChCl/EG/PSA差异较小，但β值远高于ChCl/EG/PSA。这表明ChCl/BD/PSA具有更强的氢键形成能力和脱除木质素及半纤维素能力，有利于木质纤维原料预处理。

表1 低共熔溶剂致显色化参数Table 1 Solvatochromic parameters of deep eutectic solvents

2.2 三元DES预处理对杨木组成成分的影响

采用ChCl/EG/PSA和ChCl/BD/PSA体系在120 ℃分别处理杨木0.5，1.0和1.5 h，其固体回收率及成分分析结果见表2，其中原料为未处理的杨木，ChCl/EG/PSA-0.5/1.0/1.5为经ChCl/EG/PSA处理0.5 h/1.0 h/1.5 h后的杨木，ChCl/EG/PSA-0.5/1.0/1.5为经ChCl/BD/PSA处理0.5 h/1.0 h/1.5 h后的杨木。由表2可知，杨木经三元DES预处理后，固体回收率降至42.07%～53.70%，低于氯化胆碱/乙二醇及氯化胆碱/丙三醇等中性体系，可能是对羟基苯磺酸促进了部分组分的脱除[4]。杨木中主要成分为纤维素、半纤维素及木质素，三者间的紧密结合抑制了微生物及酶的降解作用，3组分的含量变化将影响原料的酶解效率及糖产量[11]。因此，对预处理前后的杨木进行了成分分析。预处理后，纤维素的相对含量由43.70%上升到71.39%～77.54%，显著高于氯化胆碱/乳酸体系处理后桉木的纤维素含量[13]。而木聚糖含量则由15.87% 降至4.14%～7.51%，略高于氯化胆碱/乳酸体系，可能原因是较短的处理时间减少了木聚糖的降解[7]。木质素含量则从29.81%降至10.47%～16.16%。这些结果表明在三元DES预处理过程中，大量的木聚糖和木质素被脱除，同时大部分纤维素被保留。相比于耗时较长的二元DES体系，ChCl/EG/PSA和ChCl/BD/PSA两种三元DES纤维素保留率较高，将有利于后续的预处理样品酶水解[14-15]。在相同的预处理时间内，ChCl/BD/PSA体系纤维素的含量高于ChCl/EG/PSA体系，木质素和半纤维素的含量更低，更有利于后续的酶解。根据Kamlet-Taft溶剂致显色化参数分析(表1)，ChCl/EG/PSA和ChCl/BD/PSA的α和π*值相近，而ChCl/BD/PSA体系的β值更高，更易与木质素、半纤维素形成强氢键而提高木质素和半纤维素的脱除率。

在ChCl/EG/PSA三元DES体系处理过程中，随预处理时间从0.5 h延长至1.0 h，固体回收率明显下降，木聚糖及木质素的脱除率分别增至77.88% 和73.85%，但纤维素保留率略有降低；当处理时间进一步延长至1.5 h时，固体回收率仅略有上升，木聚糖及木质素的脱除率及纤维素保留率变化较小。这说明在ChCl/EG/PSA三元DES预处理过程中，随着时间的延长，组分脱除率上升，纤维素降解加剧但过度延长处理时间对进一步脱除非纤维素组分作用不明显，这与Tan等[13]采用氯化胆碱/乳酸体系处理后的桉木组分含量变化趋势一致。

表2 DES预处理对杨木组成成分的影响Table 2 Effects of pretreatment with deep eutectic solvent on chemical composition of poplar 单位:%

2.3 红外光谱分析

预处理前后样品的红外光谱(FT-IR)谱图见图1，对应官能团归属参考文献[4,16]。1 736 cm-1处的吸收峰为羰基伸缩振动，可能来源于半纤维素和木质素中的乙酰基或酯基中的羰基。ChCl/EG/PSA预处理后，1 736 cm-1峰强度减弱，说明预处理脱除了部分半纤维素，而ChCl/BD/PSA预处理后，1 736 cm-1峰强度降低更为明显，这表明ChCl/BD/PSA体系脱半纤维素效果更好，与成分分析木聚糖结果一致(表2)。1 592，1 504，1 460和1 420 cm-1处的红外吸收峰为木质素芳环的特征峰，ChCl/EG/PSA和ChCl/BD/PSA预处理后的杨木样品谱图中木质素特征峰强度明显减弱，这表明两种三元DES均具有优异的木质素脱除能力。1 364，1 322，1 238，1 162，1 104，1 040，和898 cm-1处的吸收峰为纤维素特征峰，其中1 364，1 322和898 cm-1为Ⅰ型纤维素的红外特征吸收峰，表明ChCl/EG/PSA和ChCl/BD/PSA预处理体系对纤维素晶型均无明显影响。1 040和898 cm-1为纤维素糖苷键的特征吸收峰。延长预处理时间后，其强度未见明显减弱，说明纤维素糖苷键在三元DES预处理过程中具有较高的稳定性，故大部分纤维素以固体的形式被保留，这与Ling等[15]采用甜菜碱/乳酸体系预处理毛竹后纤维素的分析结果一致。

图1 DES预处理后杨木的红外光谱图Fig. 1 FT-IR spectra of pretreated poplar by deep eutectic solvents

2.4 X-射线衍射分析

预处理前后的杨木样品X-射线衍射(XRD)图谱见图2。由图2可知，主要衍射峰15.5°，16°，22.5° 及34.6°，分别来自Ⅰβ型纤维素的(1-10)，(110)，(200)和(004)晶面，未见其他纤维素晶型的明显衍射峰，表明预处理后杨木的纤维素晶型未改变，均为Ⅰβ型，这与FT-IR分析结果一致[16]。预处理残渣结晶度(46.6%～52.3%)均高于未处理杨木(36.2%)，这是半纤维素和木质素等非纤维素组分被大量脱除，纤维素占比增加所致，与前文成分分析结果相一致。

图2 DES预处理后杨木的XRD图Fig. 2 XRD pattern of pretreated poplar by deep eutectic solvents

ChCl/EG/PSA体系预处理残渣结晶度随处理时间增加先升高后降低，这可能由于随着预处理时间增加，木聚糖及木质素被大量脱除；但预处理时间进一步增至1.5 h后，纤维素部分晶体结构被破坏，导致结晶度降低，与FT-IR和成分分析数据相一致。ChCl/BD/PSA体系回收固体结晶度先随处理时间增加而降低，反应时间进一步延长又导致纤维素结晶度升高，可能是随预处理时间增加，木质素及木聚糖等非纤维素组分进一步被脱除，纤维素结晶区占比重新升高，从而结晶度再次上升。

2.5 表面形貌分析

三元DES预处理前后杨木的扫描电镜(SEM)图见图3(A～G为×500；a～g为×2 000)。由图3可知，未处理杨木表面较为光滑，纤维规整，整体排列紧密，这阻碍了纤维素酶与纤维素的接触，不利于其酶水解。采用ChCl/EG/PSA和ChCl/BD/PSA两种三元DES分别预处理后，杨木纤维破碎化程度增加，规整结构被破坏成碎片(图3A-G)；进一步观察发现，纤维表面变得更加粗糙，出现缝隙和孔洞(图3a～g)。随着处理时间的延长，杨木纤维破碎化程度逐渐增加，说明延长预处理时间可促进DES对纤维表面的破坏。ChCl/EG/PSA和ChCl/BD/PSA三元DES预处理可以有效降低对纤维素酶的屏障作用，从而有利于纤维素酶与纤维素接触，进而提高酶水解效率。

A,a)为原料；B～D,b～d)为ChCl/EG/PSA-0.5/1.0/1.5 h处理样品；E～G,e～g)为ChCl/BD/PSA-0.5/1.0/1.5 h处理样品。图3 DES预处理后杨木的扫描电镜图Fig. 3 SEM images of pretreated poplar by deep eutectic solvents

图4 DES预处理后杨木的酶解效率Fig. 4 Enzymatic hydrolysis efficiency of pretreated poplar by deep eutectic solvents

2.6 酶水解结果分析

对未经处理和三元DES预处理样品进行酶水解，以分析预处理时间及体系对酶水解的影响，结果见图4。由图4可知，未经DES预处理的杨木原料酶解效率仅为11.74%，且随着酶解时间的延长变化不大。ChCl/EG/PSA和ChCl/BD/PSA预处理样品仅酶解24 h，纤维素转化率即分别提升至83.90%和95.08%，高于氯化胆碱/乳酸，氯化胆碱/1,4-丁二醇及氯化胆碱/甲酸体系预处理木质纤维素的酶解效率[13, 17]。相比于未处理样品，预处理样品酶水解24 h的纤维素转化率分别提高至6.04和6.84倍。与ChCl/EG/PSA体系相比，ChCl/BD/PSA脱除的木聚糖和木质素增多，预处理杨木中木聚糖和木质素含量进一步降低，纤维素暴露程度增大，导致对酶解的抑制作用更弱，使ChCl/BD/PSA预处理样品的酶解效率更高。

对于ChCl/EG/PSA及ChCl/BD/PSA体系，预处理1.5 h的原料酶解效率明显优于0.5和1.0 h，这归因于预处理后木质素及木聚糖等阻碍酶解的组分被大量脱除，减弱了物理屏障作用；同时降低了木质素及木聚糖对纤维素酶的无效吸附；而纤维表面暴露，增加了纤维素酶对纤维素的可及度，进而提高预处理杨木的酶解效率[13]。