血栓弹力图指导下抗结核药物对人凝血功能的直接影响：一项体外研究

江山 奚雷 孙杨

结核性脓胸手术常存在时间长，术中易出血，术后康复时间长，围术期管理相对复杂的特点[1]。该类患者凝血功能较差，其中抗结核药物会损伤肝肾功能，进而会对凝血功能产生影响[2]。但临床常用的异烟肼和利福平这两种药物是否会对患者体内凝血功能产生直接影响目前尚无文献报道。血栓弹力图可以直观性的观察到药物对凝血功能的影响[3-4]，较传统凝血功能检测更具有整体性、动态性的评估[5-7]。本研究拟通过血栓弹力图技术观察异烟肼和利福平这两种抗结核药物分别对人体凝血功能的直接影响，进一步探讨两种药物联合应用时，是否会对人凝血功能产生直接的相加或协同作用；为临床上结核性脓胸患者围术期可能存在的凝血功能紊乱的原因提供一定的实验参考依据。

资料与方法

一、研究对象的选择

本研究获本院伦理委员会批准(批件号：2019-KL002-01)，所有入组患者均签署知情同意书。选择2019年1月至2019年10月招募的64例志愿者。纳入标准为：1)年龄在25至60岁之间；2)身高体重指数(BMI)≤30 kg/m2；3)受试前肝肾功能检查未见异常；4)无凝血相关性疾病病史。排除标准为：1)患有严重心脏疾病、内分泌和代谢疾病、神经肌肉传导疾病、水，电解质，酸碱平衡失调者；2)肝、肾功能不全者；3)存在严重感染者；4)存在血液系统相关疾病者；5)有肿瘤史或既往接受放化疗史；6)糖尿病患者；7)正在接受抗凝治疗者。

二、研究流程

采用随机数字表法，采集每位志愿者的血样分配至下列四组：对照组(NS组)，异烟肼组(I组)、利福平组(R组)和联合药物组(C组)。每组各志愿者均采集两份血样，一份加入抗凝管中作为基线血样(分别记为NS-基线、I-基线、R-基线和C-基线)，另一份加入预处理后的抗凝管中(处理方式见下文，按组别，分别记为NS、I、R和C)。所有抗凝管均用有色纸张覆盖表面，采血者和进行血栓弹力图分析的操作者，均不知晓分组情况。

三、志愿者血样的采集

所有志愿者统一经左肘静脉采集血样。采用22 G穿刺针和管道，操作者戴无菌手套，常规皮肤消毒后进行穿刺采血。每位志愿者先采集2 mL静脉血留作基线血样；再采集1.9 mL静脉血样，加入预处理后的抗凝管中(预处理方式见下文)，两组血样静置15分钟后行血栓弹力图检测。

四、抗凝试管预处理

本研究使用3.2 %柠檬酸钠负压管作为抗凝采血管，各组在抗凝管中加入等容量的试剂。其中NS组加入0.1 mL含0.9 %的氯化钠溶液，I组加入0.1 mL异烟肼试剂(含异烟肼12 μg)；R组加入0.1 mL利福平试剂(含利福平48 μg)；C组加入0.1 mL异烟肼和利福平的混合试剂(含异烟肼12 μg和利福平48 μg)。

五、观察指标

主要观察指标包括各组中基线血样和加入试剂后血栓弹力图检测的结果，包括R时间、K时间、α角度、MA值等参数，并通过配套软件计算血块强度G值和综合凝血指数CI。其它观察指标有志愿者的一般情况，包括年龄、性别、身高体重指数(BMI)、术前血小板计数、血红蛋白浓度、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、谷氨酰转肽酶、尿素氮和肌酐的浓度、钙离子、传统凝血功能检测，包括凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APPT)、纤维蛋白原(FIB)、凝血酶时间(TT)、国际标准化率(INR)、D-二聚体(D-D)的值。

六、统计学分析

七、样本含量的计算

本研究通过预实验，结合血栓弹力图中的综合凝血指数(CI)推算样本含量。预实验共纳入8位志愿者，结果提示，异烟肼联合利福平组的CI值均低于生理盐水组和利福平组(-13.69±7.63vs. -8.63±4.24 ；-13.69±7.63vs. -7.87±3.25)；异烟肼组CI值低于利福平组(-12.82±5.50vs. -7.87±3.25)；而生理盐水组和利福平组未见明显差异。根据预实验各组所获得的CI值，计算得效应量为0.48，设双侧α=0.05，检验效能β为80 %，数据缺失率为20 %，采用G-power 3.1.9.2软件计算样本大小，计算得共需64例患者。

结 果

一、四组志愿者的一般情况比较

最终共64位志愿者参与了本次研究，每组志愿者均有16位。四组志愿者受试前的年龄、性别、身高体重指数(BMI)、术前血小板(PLT)、谷氨酰转肽酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、血红蛋白(Hb)；传统凝血功能检测术前凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原含量(FIB)、D-二聚体(D-D)和钙离子进行比较，分别进行两两比较未见统计学差异(P>0.05)(见表1)。

表1 四组志愿者一般资料

二、各组血栓弹力图的分析

1.基线血样分析：将各组基线血样进行血栓弹力图检测，结果中各组的血栓弹力图各参数比较均未见统计学差异(P>0.05)(见图1A～F)。

图1 四组基线血样的血栓弹力图结果

2.预处理后各组血样分析：四组血栓弹力图参数中R时间组间比较有差异，进一步多重比较，I组时间长于NS组和R组(P<0.05)；K时间组间比较有差异，进一步多重比较，I组和C组的K时间均长于NS组和R组(P<0.05)。α角度组间比较有差异，进一步多重比较，I组和C组的α角度均小于NS组和R组(P<0.05)；最大强度MA值组间比较有差异，进一步多重比较，I组和C组的MA值均小于NS组和R组(P<0.05)；软件计算所得的血块强度计算值 G值在组间比较有差异，进一步多重比较，I组和C组的G值均小于NS组和R组(P<0.05)；软件计算反映综合凝血功能的计算值CI组间比较有差异，进一步多重比较，I组和C组的CI值均小于NS组和R组(P<0.05)(见图2A～F)。

图2 四组加入试剂血样的血栓弹力图结果

讨 论

本研究提示，在体外离体血模型下，抗结核药物中，异烟肼和异烟肼联合利福平可能会对血液有直接的抗凝作用，未见异烟肼和利福平联合用药，会对离体血凝血功能有明显的相加或者协同作用。

接受抗结核治疗的患者存在治疗周期长、营养状态差、肝脏功能受损、结核菌毒素在体内释放等，患者会存在凝血功能的异常。在导致凝血功能异常的诸多原因中，抗结核药物对凝血功能的直接影响尚无相关研究[8]。目前围术期抗结核药物的应用强调联合、规律、全程的原则，一般在入院前采用口服四联抗结核药物治疗方案(异烟肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇)；入院后患者常将口服四联药物改为静脉给予异烟肼和利福平强化治疗，为防止手术过程中可能造成的结核菌播散和术后结核耐药菌的复发，故异烟肼和利福平的应用常持续至手术当日[9]。一些文献提示，异烟肼可能会对凝血阶段ⅩⅢ因子的活性有一定的影响，而活化的ⅩⅢ因子对纤维蛋白单体和血小板的交互交织起到重要的作用，其因子活性的降低会直接影响到血凝块的强度和稳定性[4]。本研究中异烟肼和异烟肼联合利福平的血栓弹力图中，K值延长和α角度的降低，提示血凝块交织的过程缓慢，而MA值和G值的降低反映了血凝块强度的下降，提示形成的血凝块的刚度和稳定性较差。尽管利福平在临床研究中提示可能会对一些药物的抗凝作用产生增强效应[10-11]，不过在本研究中，利福平在体外研究中并未发现存在协同效应。

本研究选择了志愿者的体外离体血模型来监测抗结核药物对凝血功能的影响，其原因有：一，长期应用异烟肼或(和)利福平会产生肝脏或者肾脏的损伤，肝肾功能的异常可能会对机体的凝血功能产生影响[12]；二，两种抗结核药物在短期应用时的血药浓度个体化差异很大，如在体内应用后，血药浓度的变化和代谢产物的影响可能会干扰整个凝血阶段的进程，继而会对血栓弹力图的结果产生一定影响[13]；三，该模型可以实现通过采用固定的抗结核药的药物浓度对凝血功能进行观察；四，采用血栓弹力图技术可以反映抗结核药物对凝血功能的整体变化，易于发现抗结核药物对全血凝血功能的阶段性的影响[5]。

本研究在药物浓度的确定中选取了最新版Park J.S.等[14]制订的异烟肼和利福平在临床上治疗剂量血药浓度的中位数。主要考虑是两种抗结核药物在个体的药代动力学差异，可能会导致抗结核药物血药浓度的波动范围较大有时甚至会超出正常的血药浓度范围，会对最终结果的判读产生一定影响，选用中位数浓度可以较好的观察两种药物在临床相关浓度中对凝血功能的影响。查阅知异烟肼的血药浓度范围为3～6 μg/mL，而利福平的血药浓度范围为8～24 μg/mL，本研究中异烟肼选用的浓度为该药的中位数4.5 μg/mL，利福平选用的是对应浓度的中位数16 μg/mL[14]。

由于血栓弹力图操作中会加入的激活剂以提高检验效能，临床上常用高岭土作为激活剂，其通过激活Ⅻ因子启动内源性凝血通路激活凝血系统，加快凝血块的形成速率；但其激活方式可能会对血栓弹力图的输出结果产生一定的影响[15]。故本研究中均未采用激活剂对全血进行激活处理，以尽可能的减少激活剂对检测结果的影响，保证了实验的稳定性。

本研究的局限性如下：一，本研究为体外研究，而体内一些更为复杂的凝血因子(如蛋白C系统、抗凝血酶系统和组织因子途径抑制物等)也可能会对凝血结果产生一定的影响；二，考虑到抗结核药物在体内的血药浓度，可能会有不同程度的差异，因此不同血药浓度的抗结核药物对凝血功能的直接影响尚需进一步研究；三，本研究观察了围术期常用的药物异烟肼和利福平对凝血功能的直接影响，抗结核治疗中的其它药物，如乙胺丁醇和吡嗪酰胺是否也会对凝血功能产生直接影响，有待进一步的探究。

总之，在离体血模型中，通过血栓弹力图提示抗结核药物中异烟肼可能会对血样产生低凝效应，而异烟肼联合利福平产生的低凝状态未见明显的协同和相加作用。