ILK刺激TLR2信号通路活化在肺动脉高压中的作用机制

杨宏飞 张启杰 邵良发

肺动脉高压(Pulmonary arterial hypertension，PAH)是一种进行性疾病，其可增加肺血管阻力，从而发展为右心室肥大和衰竭，这是PAH死亡的原因[1]。由于PAH的病因多样，目前尚无长期有效的治疗方法[2]。PAH的主要标志是内皮细胞(Endothelial cell，EC)功能障碍，因此关注内皮功能的改善可能是一种有效的方法[3]。内皮-间质转化(Endothelial-mesenchymal transition，EndMT)是内皮功能障碍的复杂事件，先前的研究表明EndMT发生在PAH小鼠和患者中[4]。然而，EndMT在MCT诱导的PAH中的调节机制尚不清楚。整联蛋白连接激酶(Integrin-linked kinase，ILK)是整合素和生长因子信号通路的交联结构蛋白，广泛存在于各种类型的细胞中，在传递细胞信号信息方面起着至关重要的作用。ILK与整联蛋白β1和β3亚基相互作用，并参与整联蛋白介导的信号转导[5]。目前，大量研究证实ILK过表达促进血管内皮细胞发生EndMT[6-7]。此外，ILK促进肺泡和气道上皮细胞的增殖，并导致发育中的肺部形态发生改变[8]。所有这些结果提示ILK可能参与PAH相关的EndMT过程。但是，ILK在PAH中的生物学功能尚不清楚。本研究确定了ILK在实验性PAH模型中表达情况，分析其在PAH病理中的作用，并通过生物信息技术确定了ILK的潜在靶基因，以探索其调控EndMT的潜在机制。

资料与方法

一、动物模型与血流动力学测量

96只SPF级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(180～220g)从辽宁长生生物技术股份有限公司购买，并饲养在标准环境中。所有动物自由获得食物和水。在实验1中，大鼠(n=24)随机分为对照组和野百合碱(monocrotaline，MCT)诱导的PAH(MCT-PAH)组，每组12只。MCT-PAH组大鼠经皮下注射了60 mg/kg MCT(美国MedChem Express公司)注射建立PAH模型。对照组(n=12)注射相同体积的溶媒溶液。

此外，在实验2中，动物(n=72)随机分为4组，每组18只：对照组、MCT-PAH组、MCT-PAH+sh-ILK组和MCT-PAH+sh-NC组。sh-ILK或sh-NC(由上海吉凯基因医学科技股份有限公司构建)分别在MCT治疗前48h，MCT治疗后第7天和第14天经鼻内递送给大鼠(每只大鼠2×108TU/mL)。

注射MCT后21天，麻醉大鼠，测量血流动力学。用BL-420S生物数据采集分析系统(成都泰盟软件有限公司)和导管连接的压力传感器记录右心室收缩压(RVSP)和平均肺动脉压(mPAP)。血液动力学测定后，收集大鼠肺组织作进一步检查。实验1：每组取6只大鼠进行免疫荧光染色，每组取6只动物进行ELISA分析。实验2：每组6只大鼠进行蛋白检测，每组6只大鼠进行组织学检查，其余动物(n=6/组)进行心室重构测量。

二、细胞培养

根据先前的研究[9]，从正常雄性SD大鼠的肺动脉中分离出大鼠肺动脉内皮细胞(rat pulmonary arterial endothelial cells，rPAEC)。在含有10%胎牛血清(FBS；美国Hyclone公司)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM；美国Gibco公司)中培养细胞。 每2天更换一半培养基，每3～4天传代一次细胞。第三次传代后，将细胞用于实验。将5 ng/mL TNF-α(北京义翘神州生物技术有限公司)、5 ng/mL TGFβ1(武汉优尔生生命科学装备有限公司)和0.1 ng/mL IL-1β(北京义翘神州生物技术有限公司)添加到rPAECs生长培养基中诱导EndMT(I-EndMT)。在以下实验中分别检测在第2天、第4天和第6天I-EndMT细胞中ILK的表达。

三、慢病毒构建

对于过表达慢病毒构建，使用的寡核苷酸序列(5′-3′)为：ILK正义gatccgAACATTCATTGCTGTCG GTGGGTttcaagagaACCCACCGAGCAATGAATGATTTTT tttta和反义agcttaaaaaaAAAACATTCATTGCTCGGTGG GTtctcttgaaACACACACCGACAGC；NC 正义tTTCTCCG AACGTGTCACGTttcaagagaACGTGACACGTTCGGAGA AAttttttc和反义tcgagaaaaaaTTCTCCGAACGTGTCA CGTtctcttgaaACGTGACACGTTCGGAGAAa。对于沉默慢病毒构建，使用的寡核苷酸序列(5′-3′)是：ILK正义tgACCCACCGACAGCAATGAATGTTttcaagagaAACA TTCATTGCTGTCGGTGGGTTTttttc和反义tcgagaaaaaa ACCCACCGACAGCAATGAATGTTtctcttgaaAACATTCT GGTG；NC正义tgTTCTCCGAACGTGTCACGTttcaagaga ACGTGACACGTTCGGAGAAAttttttc和反义tcgagaaa aaaTTCTCCGAACGTGTCACGTtctcttgaaACGTGACACG TTCGGAGAAca。将过表达或沉默ILK的序列插入与pSico慢病毒载体系统(美国Addgene公司)的HapI和XhoI限制性酶切位点之间。

四、右室肥厚指数(RVHI)的测定

收获右心室(RV)，左心室(LV)和中隔(S)并称重。然后通过RV /(LV + S)的比率计算RVHI，以评估右心室重塑。

五、苏木和曙红(HE)和免疫荧光染色

将肺组织固定在低聚甲醛中，包埋在石蜡中，并切成5 μm厚的载玻片。使用HE染色试剂盒(沈阳万类生物科技有限公司)进行染色以评估肺血管重塑。从每只大鼠一个切片，并在3个随机视野中测量肺动脉，通过以下公式评估肺动脉壁厚度：(外径-内径)/外径×100%。

对于双标记免疫荧光，肺部切片用CD31抗体(1 ∶100；英国Abcam公司)和α-SMA抗体(1 ∶100；英国Abcam公司)的一级抗体在4℃孵育过夜。然后使用特异性二抗：FITC标记的山羊抗小鼠抗体(1 ∶200；上海Beyotime公司)和Cy3标记的山羊抗兔抗体(1 ∶200；上海Beyotime公司)在37℃下孵育1h。使用DMIL倒置荧光显微镜(德国Leica公司)获取图像。

六、酶联免疫吸附测定(ELISA)

收集肺组织的上清液，用BCA蛋白测定试剂盒(北京Solarbio公司)定量蛋白质浓度。然后，通过ELISA试剂盒(购自杭州联科生物技术有限公司)测量TNF-α、TGFβ1和IL-1β的浓度。

七、 Western blot

收获肺组织或rPAEC，并用含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液(北京Solarbio公司)进行裂解。通过BCA蛋白质测定试剂盒测量蛋白质浓度。然后，将相同体积的蛋白质样品分离并转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF；美国EMD Millipore公司)上，用5%脱脂乳封闭1 h。膜用一抗免疫印迹孵育过夜。一抗包括：ILK(1 ∶500；英国Abcam公司)，VE-cadherin(1 ∶400；武汉Boster公司)，N-cadherin(1 ∶1000；武汉Boster公司)，Vimentin(1 ∶1000；武汉Boster公司)，TLR2(1 ∶1000；美国CST公司)和GAPDH(1 ∶10000；美国Proteintech公司)。然后使用辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔(1 ∶3000；Solarbio)或山羊抗小鼠(1 ∶3000；Solarbio)二抗孵育1h，并通过化学发光法进行检测。

八、微阵列分析

一对rPAEC细胞(稳定转染ILK基因的rPAEC细胞和相应的阴性对照)用于微阵列分析。具体操作为，从细胞中提取的总RNA被扩增并转录成荧光互补DNA(cDNA)，然后与8×60K mRNA表达微阵列。用Agilent扫描仪G2505B对阵列进行扫描。使用genespringxv11.5软件包对采集的数据进行标准化并通过GEO数据库收集转录组GSE113439数据集进行分析。最后，选择折叠变化≥2.0且P<0.05的mRNAs作为差异表达mRNAs。

九、统计分析

所有统计分析均使用Graphpad Prism7.0软件进行，结果以平均值±标准差表示。两组定量数据比较采用t检验的方法；多组定量数据采用单因素方差分析，多组之间多重比较采用Tukey事后检验进行分析。P<0.05认为具有统计学意义。

结 果

一、 MCT诱导的PAH大鼠模型中EndMT

为了探讨MCT注射后PAH大鼠的症状，研究首先确定了血流动力学。如图1A和B所示，MCT诱导的大鼠的RVSP(图1A)和mPAP(图1B)高于对照组(P<0.001)。为了确定MCT-PAH大鼠模型中EndMT细胞的存在，在MCT-PAH大鼠的肺切片中观察到CD31和α-SMA的共表达，而在对照组织中则很少(图1C)。图1D的结果表明PAH增加了炎症细胞因子的浓度，包括TNF-α、TGFβ1和IL-1β。 此外，与对照组相比，ILK在MCT诱导的PAH大鼠中表达显著上调(P<0.001)(图1E)。

二、 ILK敲低改善MCT-PAH大鼠肺动脉高压、肺动脉肥大和右心室重构

首先，在sh-ILK慢病毒感染的MCT-PAH大鼠肺组织中观察到ILK蛋白表达较对照组显著下调(P<0.05)(图2A)。接下来观察了ILK下调对PAH症状的影响。如图2B和C所示，ILK敲低显著降低MCT诱导的RVSP升高(图2B)和mPAP升高(图2C)。肺组织的组织学结果显示，与MCT-PAH大鼠相比，ILK敲低降低了肺动脉壁的厚度(图2D和E)。此外，ILK敲低改善了MCT-PAH诱导的RVHI上调(图2F)。

图1 在MCT诱导的PAH实验模型中检测到EndMT。A和B：通过血液动力学测量MCT诱导的PAH大鼠RVSP(A)和mPAP(B)水平。C：肺部免疫荧光分析显示在MCT诱导的PAH大鼠中CD31(绿色)和α-SMA(红色)共定位(×400)。白色箭头表示共定位。比例尺=50 μm(×400)。D：ELISA法检测MCT诱导的PAH大鼠血清中炎性细胞因子(TNF-α、TGFβ1和IL-1β)的含量(×400)。E：Western blot检测MCT诱导的PAH大鼠肺组织中ILK蛋白表达。与对照组相比，***P<0.001。

图2 ILK敲低改善MCT-PAH大鼠肺动脉高压、肺动脉肥大和右心室重构。A：Western blot结果显示sh-ILK慢病毒感染可逆转MCT诱导的PAH大鼠ILK水平上调。B和C：ILK敲低抑制MCT诱导的PAH大鼠RVSP(B)和mPAP(C)上调。D和E：HE染色显示ILK敲低对PAH大鼠肺壁厚度有抑制作用(×400)。比例尺=50μm。F：ILK敲低降低MCT-PAH大鼠RVHI。与对照组相比，**P<0.01、***P<0.001；与MCT-PAH+sh-NC组，#P<0.05。

三、 ILK敲低阻断EndMT

为了了解ILK在EndMT中的作用，利用Western blot测定肺组织EndMT标记物的变化。结果显示，与MCT-PAH+sh-NC组相比，MCT-PAH+sh-ILK组肺组织中VE-cadherin蛋白的表达水平显著上调(P<0.05)，并且N-cadherin和Vimentin蛋白的表达水平显著下调(P<0.05)(图3A和B)。在体外研究中，在I-EndMT第4天和第6天rPAECs细胞中ILK蛋白表达较对照组显著上调(P<0.001)(图4A和B)。此外，与体内结果一致，ILK敲低逆转了I-EndMT诱导的rPAECs细胞中VE-cadherin减少和N-cadherin、Vimentin增加(图4C和D)。

图3 ILK敲低减弱MCT诱导的PAH大鼠EndMT过程。A和B：Western blot结果显示ILK敲低逆转了MCT诱导的内皮细胞标志物(VE-cadherin)的减少和间充质细胞标志物的增加(N-cadherin和Vimentin)。与对照组相比，***P<0.001；与MCT-PAH+sh-NC组，#P<0.05、##P<0.01。

图4 ILK敲低减弱rPAECs进行I-EndMT。A和B：Western blot检测炎性细胞因子诱导rPAEC发生EndMT过程中ILK蛋白表达变化。C和D：Western blot显示ILK敲低逆转了I-EndMT诱导的内皮细胞标志物(VE-cadherin)的减少和间充质细胞标志物的增加(N-cadherin和Vimentin)。与对照组相比，***P<0.001；与I-EndMT+sh-NC组，#P<0.05、##P<0.01。

四、 ILK靶向TLR2

为了鉴定ILK诱导作用的潜在介体，利用微阵列技术的GSE数据库对转染了ILK或非靶向性对照LV-NC的rPAECs进行了差异表达基因分析。基于生物信息技术，研究确定了一系列在转染了ILK的rPAECs细胞中高表达的基因，包括TLR2(图5A)。然后，研究测试了TLR2在I-EndMT rPAEC中的变化。如(图5B-C)所示，与对照组相比，I-EndMT显著增加了rPAECs中TLR2蛋白表达(P<0.001)，这被ILK敲低所阻止(P<0.01)。

图5 ILK靶向TLR2。A：选择GSE113439分析在转染了ILK或非靶向性对照LV-NC的rPAECs中均发生变化的差异表达基因，并通过热图显示了前26个差异表达基因。绿色和红色分别代表下调和上调。B和C：Western blot显示I-EndMT可增加rPAECs中TLR2蛋白水平，而ILK敲低可降低TLR2表达。与对照组相比，***P<0.001；与I-EndMT+sh-NC组，##P<0.01。

讨 论

PAH是一种复杂的心血管疾病，死亡率很高。肺动脉重塑逐渐导致肺血管阻力和肺动脉压力增加，并最终引发右心室衰竭和死亡[1]。最近研究证实，EndMT在肺动脉重塑中起关键作用，进行End-MT的肺动脉ECs具有间充质样细胞的迁移能力并渗透到肺动脉介质中[10]。ILK是一种分子量为59kDa的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。它是整联蛋白和生长因子信号通路的交联结构蛋白[5]。ILK作为衔接蛋白在各种细胞类型中广泛表达，并能作为蛋白激酶调节细胞骨架装配和来自粘着部位的信号转导[7]。最近研究发现，ILK对肿瘤微环境中内皮细胞的EndMT分化至关重要[11]。因此，本研究重点分析了MCT-PAH中ILK与EndMT进程之间的关系。结果显示，ILK敲低抑制了MCT-PAH大鼠的肺动脉高压，肺动脉肥大，右心室重构和EndMT进程。此外，体外实验进一步证实rPAEC中的ILK敲低可以使EndMT进程减弱。观察结果支持ILK通过直接靶向TLR2参与EC的EndMT来促进PAH。

众所周知，MCT暴露通常用于模拟PAH的症状[12]。在本研究中，MCT大鼠的病理变化包括RVSP、mPAP和炎性细胞因子的增加，肺动脉壁增厚以及右心室肥大，这与以前的研究一致[12]，表明成功建立了PAH动物模型。在PAH大鼠中，我们还观察到ILK表达明显升高，表明它可能与PAH的发生和进程有关。此外，ILK敲低减少了PAH大鼠的RVSP、mPAP、肺动脉重塑和右心室重塑的改变。这些结果表明，ILK是PAH的潜在诱发因素。在进一步分析ILK在PAH诱导的EndMT中的作用时发现，MCT诱导的PAH大鼠肺组织中存在CD31和α-SMA共表达，表明在PAH大鼠中存在EndMT[13]。重要的是，ILK敲低可减少内皮标志物并增加间充质标志物表达。这些结果表明，ILK对PAH高血压和血管重构的诱导作用可能归因于促进EndMT。

EndMT代表炎症应激和内皮功能障碍之间复杂相互作用的关键环节。研究发现PAH和系统性硬化症患者血清中的TNF-α和IL-1β等炎性细胞因子升高[2]。一致地，本研究观察到MCT-PAH大鼠中TNF-α、TGFβ1和IL-1β升高。在单用TNF-α、IL-1β或TGFβ1刺激下，EndMT通过多种信号传导途径在不同的内皮细胞中被诱导[14]。另外，Good等研究结果显示，TNF-α、IL-1β和TGFβ1组合可诱导PAECs的EndMT，并且EndMT细胞表现出形态学变化以及内皮和间充质标志物的变化[15]。本研究表明，rPAECs响应TNF-α、TGFβ1和IL-1β的组合并向间充质细胞表型过渡。ILK的表达在I-EndMT细胞中升高，其敲低减弱了I-EndMT的过程。这些体外结果表明ILK敲低通过抑制EndMT对内皮功能障碍产生有益影响。此外，基于生物信息技术，研究确定了TLR2作为ILK潜在靶基因。TLR2已被证明可调节心脏和肾脏组织以及主动脉瘤和主动脉狭窄中血管紧张素Ⅱ诱导的炎症反应[16]。考虑到炎症也是EndMT和内皮功能障碍的诱导因素[17]，支持了本研究中ILK通过直接靶向TLR2，诱导EndMT并促进PAH发展的结论。

总之，本研究数据证实EndMT过程可以发生在PAH的肺内皮细胞。此外，ILK通过靶向TLR2参与EndMT过程。这些发现提示ILK正性调节TLR2，从而在MCT诱导的PAH中促进EndMT，可作为PAH治疗的新靶点。