S100A2通过促进细胞分裂、侵袭、迁移及抑制凋亡促进Calu-6肺癌细胞株生长

杜歌 刘自双 魏莉 刘芳芳 陈子浩

肺癌是发病率及死亡率较高的恶性肿瘤[1], 因大多数患者就诊时已处于中晚期，肺癌的预后不佳[2]。肺癌的早期诊断方法包括影像学检查、生物标记物检测、支气管镜检查术等。其中，生物标记物检测因便捷、无创性等特点成为临床上常用的检测手段，高敏感度及特异度的生物标记物对提高早期肺癌诊断率、降低死亡率是十分必要的。

S100蛋白家族是钙结合蛋白中较大的一个亚家族，包含25个已知成员，其中多个成员在包括肺癌在内的多种肿瘤中异常表达[3]。S100A2作为S100蛋白家族中特殊的一员，在肿瘤中的作用存在争议[4]。1992年，学者首次报道该蛋白在乳腺癌中表达下调，认为其可能为抑癌因子。然而，随后又出现了许多与之相反的观点[5]，S100A2在肿瘤中的具体作用也尚未明确。本研究拟从细胞水平证实S100A2与肺癌关系，评价其在肺癌发生发展中的作用，期望为其日后作为诊断工具应用于临床提供依据。

资料与方法

一、细胞培养

实验选用肺癌细胞Calu-6，该细胞株采购于中国科学研究院，使用10%FBS的DMEM培养基培养，培养条件为5%CO2，37℃。细胞经复苏后，培养1～2周，调整细胞状态后进行实验。

二、构建过表达S100A2的稳转细胞株

构建pcDNA3.1-S100A2过表达质粒：S100A2源于人基因，基因信息参考网站：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6273。用pcDNA-S100A2聚合酶链反应(PCR)方法制备PLVX-AcGFP1-N1-S100A2。引物设计如下：正向引物为5-CCCAAGCTTACCATGTGCAGTTCTCTGGAGCAG-3′，反向引物为5′-GACGGGTCTGGCTGGGCCTTAAGGC-3′。(2)慢病毒包装：分别将目的基因质粒和辅助质粒混合后，转染 293T 细胞，采用 Lipofectamine2000转染体系。转染后 48h 收获富含慢病毒颗粒的细胞上清液，1500rpm 离心 5min，0.45μm 滤膜过滤，收取病毒。(3)慢病毒载体感染肺癌细胞：将细胞接种到 6 孔板中，次日将1μl 8 mg/mL 的聚凝胺加入1mL慢病毒中，再加入1mL无血清的培养基。吸弃细胞培养基，加入含慢病毒颗粒的培养基。细胞培养箱中静置4h后，换成完全培养基。于感染后48h，加入含50 mg/mL G-418的完全培养基，筛选稳定感染的细胞株，设定为Calu-/S00A2实验组。同时，将肺癌细胞株及慢病毒作为空载体感染后的肺癌细胞株分别设定为Cal-6/空细胞对照组及Calu-6/空载体对照组。感染48h后荧光显微镜下观察感染效率。收集细胞样本进行QPCR和Western blot方法检测 S100A2表达，验证过表达效果。

RNA提取和QPCR：使用TRIzol试剂进行细胞裂解，离心收集上清液，然后在上清液中依次加入氯仿、2-丙醇和75%乙醇，分离RNA，使用Nanodrop 2000检测RNA的浓度和纯度。使用RevertAid First Strand cDNA合成试剂盒进行反转录，参照说明书执行所有步骤。PCR的具体步骤和条件为：孵育(95℃、5min)、变性(94℃、30s共44周)、退火(55℃、30s)、延伸(72℃、30s)。此外，PCR中使用的引物信息如下：S100A2正向引物(5′-GCCAAGAGGGCGACAAGTT-3′)和S100A2反向引物(5′-AGGAAAACAGCATACTCCTGGA-3′)；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH，内源性对照)正向引物(5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′)和GAPDH反向引物(5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′)。

Western-blot：筛选稳定感染的细胞株，48h后荧光显微镜下观察感染效率，确定感染成功后，收集细胞，使用总蛋白提取试剂盒进一步获取细胞裂解物，裂解物在14000rpm下离心10分钟，添加上样缓冲液后在95℃下加热5分钟，用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺分离后转移到硝化纤维素膜上。使用5%脱脂奶粉，室温封闭2h，后加入S100A2一抗(稀释度1/500)，4℃孵育过夜。同时，将小鼠GAPDH抗体作为内源性对照。随后冲洗膜，加入辣根过氧化物酶标记聚合物的二抗(1/5000稀释液)，再次冲洗，然后使用增强化学发光法观察成像。

三、MTT增殖曲线测定

取处于对数生长期的Cal-6空细胞对照组，Calu-6/空载体对照组，Calu-6/S00A2实验组细胞分别离心制成细胞悬液，调整细胞浓度至5～10×104/mL。将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，吸取100μl细胞悬液接种于96孔板中，每组设置3个复孔，用无菌PBS填充边缘孔。将培养板放入培养箱中，分别在培养12h，24h，48h，72h，96h时间点取出酶标仪测定吸光度。吸弃上清，加入90μl新鲜培养液，再加入10μl MTT溶液(5 mg/mL)，继续培养4 h。然后吸掉上清，每孔加入100μlFormazan溶解液，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值。

四、Transwell检测细胞迁移和侵袭

包被基底膜：50 mg/L Matrigel 1.8稀释液80μL包被Transwell小室底膜的上室面，4℃晾干。水化基底膜：吸出培养板中残余液体，每孔加入50μl含10g/L牛血清白蛋白(BSA)的培养液，37℃，30min。制备细胞悬液：取三组对数期生长的细胞，0.25%胰酶消化并收集细胞，800rpm离心5min，弃上清液，用无血清DMEM 培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度为 1×106个/mL。加样：取细胞悬液200μl加入Transwell上小室，24孔板下室加入600μl含FBS的培养基。细胞计数：常规培养48h后，用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，75%预冷的酒精固定30min，再用0.1%结晶紫染色10min。置显微镜下观察，拍照并计数。

五、流式细胞术

取三组对数期生长的细胞制成细胞悬液(步骤同前)，调整其细胞浓度为3×105/mL。制备好细胞悬液后，将其轻轻混匀，吸取2000μl接种于6孔板，将6孔板置于培养箱培养48h后进行流式检测。将3组细胞分组处理后4℃、1000rpm离心5min，去除上清，加入5 mL PBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃去上清，重复两次，最后重悬细胞于0.5 mL PBS中。吸弃PBS，加入100μl 1×Binding Buffer重悬细胞。然后加入10μl的PI和5uL的Annexin V-FITC染色液，轻轻混匀。室温避光反应15min。加入400μl 1×Binding Buffer，混匀后置于冰上，在1小时内用流式细胞仪检测。

在流式细胞检测细胞周期检测过程中，重悬于0.5 mL PBS中的细胞用低速振荡器边震动边加入5 mL预冷的75%乙醇中4℃过夜固定，次日将固定好的细胞离心5分钟(4℃、1000rpm)，弃去上清，用PBS洗涤一次，用0.4mL PBS重悬细胞。然后加入100μl RNaseA溶液处理，重新悬浮，在37℃的水中浸泡30分钟。在400μl PI染色液存在下，将细胞沉淀在黑暗中4℃培养30分钟，然后在488nm的波长下用流式细胞仪分析混合物。使用Cell Quest和MidFit软件来确定细胞周期，主要包括G1、S、G2三个阶段。

六、数据处理

使用SPSS 22.0分析数据， GraphPad-Prism 7.0制作曲线图、柱状图，每组细胞均设有两组重复对照组，最后所得数据为三组表达水平的平均值，柱状图中数值显示为平均值±标准误。需要指出的是，在绘制增殖折线时，因每组与重复组吸光值相差值太小，故GraphPad-Prism 7.0制作出的折线图中未显示标准误。使单因素方差分析比较符合正态分布的三组数据差异，使用秩和检验分析不符合正态分布的三组数据差异，MTT实验数据及细胞周期中比较各组差异采用双因素方差分析，定义P<0.05为有统计学意义。

结 果

一、实验组及对照组S100A2 mRNA和蛋白表达情况

感染48小时后，使用荧光显微镜、RT-PCR和Western blot方法确认感染是否成功。(图1)中1a和1b所示，与对照组相比，感染后Calu-6/S100A2实验组S100A2 mRNA及蛋白表达明显升高。同时，荧光显微镜下可见感染S100A2过表达慢病毒载体后Calu-6细胞株绿色荧光强度变弱，也提示感染成功(见图1C)。

图1 S100A2在三组细胞中mRNA(A)和蛋白(B)表达及荧光对比图(C)(×200)

二、S100A2促进细胞增殖及迁移能力

MTT实验结果显示(图2)：与两组对照组相比，Calu-6/S100A2实验组细胞在12h，24h，48h，72h，96h吸光值均高(P<0.05)。在检测细胞迁移能力的实验结果中(图3)，Calu-6/S100A2实验组细胞数量平均为412.6±11.26，明显高于Calu-6空细胞对照组 (209.8±5.16)和Calu-6/空载体对照组(231.0±8.86)(P<0.05)。

图2 各组细胞增殖能力对比图

图3 各组迁移能力差异图

三、S100A2促进细胞侵袭能力

在检测细胞侵袭能力的实验结果中(图4)，Calu-6/S100A2实验组细胞数量平均为(485.3±10.68)，高于Calu-6空细胞对照组 (236.7±4.91)和Calu-6/空载体对照组(228.0±7.94)(P<0.05)，提示实验组细胞侵袭能力增强。

图4 各组侵袭能力差异图

四、S100A2抑制Calu-6细胞株凋亡、影响细胞周期

(图5)显示了各组细胞凋亡百分比，Calu-6/S100A2实验组细胞凋亡的平均比例为(6.32±0.02)%，低于Calu-6空细胞对照组(8.86±0.41)%和Calu-6/空载体对照组(8.01±0.07)% (P<0.05)。(图6)展现了各组细胞周期的变化，与对照组相比，Calu-6/S100A2组细胞处在G1期的比例相对较低，处于S期的细胞百分率较高，说明S100A2可促进Calu-6肺癌细胞株从G1期向S期转变。更具体地说，三组细胞中处于G1期的细胞比例分别为(57.08±0.54)% (Calu-6空细胞组)，(58.96±0.16)% (Calu/neo空载体组)和(39.66±0.58)% (Calu-6/S100A2组)。三组处于S期的细胞比例分别为(22.58±0.81)% (Calu-6空细胞对照组), (23.79±2.12)% (Calu-6/空载体对照组)和 (36.69±0.67)% (Calu-6/S100A2实验组)，P<0.05。

图5 各组细胞凋亡能力对比图

图6 各组细胞周期变化对比图

讨 论

在本研究中，我们构建了S100A2表达慢病毒载体，并将其感染Calu-6细胞，进一步探讨了S100A2在肺癌细胞系中的作用。通过比较Cal-6/空细胞对照组，Calu-6/空载体对照组，Calu-/S00A2实验组的细胞生物学行为，证实S100A2的高表达与细胞高增殖、侵袭、迁移及凋亡之间相关，S100A2在细胞水平上促进肺癌的发生、发展。

近年来，S100蛋白家族因在多种肿瘤中表达异常，受到越来越多的关注，研究证实该家族中很多成员可与Ca2+结合并激活Ca2+介导的信号通路进一步参与多种细胞活动，如细胞分裂、侵袭等。S100A2是S100蛋白中重要且有特殊作用的一员，其含99个氨基酸的蛋白，位于易发生重排的染色体1q21上。既往研究证实，S100A2在不同种类的肿瘤中均有异常表达，参与调控肿瘤细胞的多种生物学行为。S100A2的特殊性在于其在不同肿瘤中有不同作用，且在同一肿瘤中有不同表达。例如，S100A2最初由Lee等人发现在正常乳腺上皮细胞中表达，而在乳腺肿瘤细胞中表达下降，且在肿瘤细胞暴露于DNA甲基化抑制剂后，该蛋白被重新激活表达，故Lee等学者认为S100A2可能与S100蛋白家族中大多数成员不同，可能在恶性肿瘤中起抑癌作用[6]。然而，在接下来的几十年中，关于S100A2与癌症的研究越来越多，相互矛盾的发现也不断涌现。例如，在胃癌中，研究人员发现Western-blot分析验证S100A2表达降低，且这种低表达水平与肿瘤低分化、高侵袭及高远处转移率有关[7]。在胆管癌中的研究表明，S100A2和S100A4、S100A6和S100P等其他S100蛋白家族一样，在瘤变的胆管上皮细胞中及肝门胆管癌癌细胞中表达升高[8]。故S100A2在肿瘤中所起的具体作用尚无统一结论。

在肺癌中，关于S100A2表达和具体作用机制也有一些不一致的研究成果出现。最早的研究在2001年，研究人员利用cDNA阵列筛选正常支气管上皮细胞(NHBE)和肿瘤细胞系1170-I，结果显示S100A2编码核钙结合蛋白在1170-I中表达下降，S100A2 mRNA和编码蛋白均下调，在75%～83%的肺正常组织和增生组织中S100A2均可被检测到，但在腺癌及鳞癌标本中检测阳性率不足10%[9]，提示S100A2在肺癌中可能扮演一个抑癌的角色[10]。然而，很快，相反的研究结论就出现了。Wang等人对113例I 期非小细胞肺癌组织的免疫组化的研究表明，S100A2在肺癌组织中表达升高，且高表达S100A2的患者预后差。Heighway等学者利用一组cDNA微阵列进行双通道基因表达分析，它们的微阵列、RT-PCR、Western-blot和免疫组化数据均表明S100A2在非小细胞肺癌中高表达[11]。这些观点还得到了许多后续研究的支持，其中一些研究还发现S100A2与肺癌的淋巴转移和预后不良有关。

关于S100A2具体的作用机制，S100A2被证实可通过p53蛋白和TGF-β诱导的MAPK信号通路参与TGF-β介导的细胞迁移和侵袭。同时，S100A2还可促进TGF-β/Smad3靶基因的转录，进一步促进该通路介导的肿瘤进展[12]。在前人的研究基础上，有的学者提出S100A2在肺癌中可能起双重作用，即在肺癌早期阶段中起到促癌作用，表达升高，但随着肿瘤进展，可能表达有所下降[13]，该蛋白在肺癌中的确切作用及具体机制有待于进一步研究。我们的研究结果与Heighway等学者所持观点一致，即S100A2有促癌作用，未来我们也将使用多种细胞株、多水平进一步证实S100A2与肺癌的关系。

我们此次的研究证实在细胞水平上，S100A2对肺癌细胞的分裂增殖、迁移及侵袭能力均有促进作用，未来此蛋白有望作为有效的生物学标记物辅助诊断肺癌及评估预后。