基于核磁共振代谢组学技术比较不同产地铁棍山药的化学成分差异

魏 亮，张超楠，李科研，位婷婷，祁少可，王艳丽*，王 强，2，3*

（1.河南省生殖健康科学技术研究院 国家卫健委出生缺陷预防重点实验室，河南 郑州 450002；2.河南省科学院高新技术研究中心，河南 郑州 450002；3.郑州工业应用技术学院 药学与化学工程学院，河南 新郑 450064；4.河南广电计量检测有限公司，河南 郑州 450001）

山药是薯蓣科植物的干燥根茎，属多年生缠绕草本植物，始载于《神农本草经》［1］，具有补脾养胃、生津益肺、补肾涩精等作用［2］。山药大致可分食用、药用两类［3］，食用山药称薯，广泛分布于非洲、亚洲、南美洲部分地区以及加勒比海和南太平洋的岛屿，是热带和亚热带地区人们的主食［4］。我国食用山药主要分布在南方诸省，药用山药分布较北，主要以河南、山西、山东、河北为主［5］。此外，在朝鲜、日本等国也有分布［6］，并形成了地方品种。

道地药材是指经过中医临床长期应用筛选出来的，产自特定地区，通过特定生产过程，较其他地区所产同种药材质优效佳的药材，它是优质中药材的代名词，其质量优劣与后续临床用药疗效直接相关［7-8］。山药自明代以后的道地产地逐渐集中到河南古怀庆府，即怀山药。《本草蒙筌》云：“南北郡俱产，惟怀庆者独良”［9］。《本草原始》曰：“今人多用怀庆者，肉白指喜细，紧实者入药”［10］。20 世纪30 年代《药物出产辨》更是明确山药“产河南怀庆府、沁阳、武陟、温孟4 县”［11］。怀山药是地理标志产品［12］。铁棍山药是怀山药中的一种，被认为是其中的极品［13］。

传统上，道地药材用眼观、手摸、鼻闻、口尝等主观的性状鉴别来判定，而现代多采用高效液相色谱、毛细管电泳、质谱等设备利用化学指纹图谱对道地药材进行鉴别［14］。本小组在前期研究中比较了温县铁棍山药与山东、山西种植铁棍山药以及山东、河北地方品种山药中化学成分的差异以及鉴别方法［15］，本文则比较了沁阳、武陟、温县、孟州4地垆土地和沙土地产铁棍山药之间的化学成分差异。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

400 MR核磁共振波谱仪（美国安捷伦公司）；UltiMate3000高效液相色谱仪、超声波振荡器、HILIC氨 基 色 谱 柱（150 mm × 4.6 mm，2.6 μm）、Hypersil ODS C18色 谱 柱（60 mm × 4.6 mm，3 μm）（ThermoFisher 公司）；ME204E 型万分之一天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；涡旋振荡器、高速离心机（大龙兴创实验仪器（北京）股份公司）。

重水（D2O）和氘代甲醇（CD3OD）购自青岛腾龙微波科技有限公司。乙腈（色谱纯）购自默克公司。磷酸二氢钠、磷酸氢二钠购自天津科密欧化学试剂有限公司。

7种铁棍山药均采集自焦作地区，详细信息见表1。原植物经河南中医药大学谢小龙副教授鉴定为铁棍山药（Dioscorea polystachyaTruczaninow cv.Tiegun）。

表1 铁棍山药样品信息Table 1 Sample information of Dioscorea polystachya Truczaninow cv.Tiegun

1.2 山药处理方法

山药采集后当天去掉泥土，洗净，去皮后切片烘干，粉碎得山药粉，备用。

1.3 核磁共振分析

1.3.1 测试样品制备称取山药粉（50 mg），加入0.4 mL 的磷酸缓冲液（0.05 mol/L Na2HPO4和NaH2PO4的重水溶液）以及0.4 mL 氘代甲醇，涡旋振荡（3 min），离心（10 000 g，5 min），吸取上清液（550 μL）置于5 mm样品管中。

1.3.2 测试条件核磁共振氢谱于室温（298 K）测定，5 mm OneNMR 探头，脉冲序列为PRESAT 以压制样品中的水峰，扫描次数64，谱宽4 800 Hz，采样点数16 K，弛豫时间2 s，采集时间3.408 s。

1.3.3 数据分析将采集得到的1H NMR 图谱信号用MestreNova 软件进行傅里叶变换，设置谱宽因子为0.3 Hz 的指数窗函数，手动进行相位校正，基线校准，以3-（三甲基硅基）氘代丙酸钠（TSP）为内标（δ0.0）校正位移。以δ0.02 为积分间隔对化学位移在δ0.5～9.5 之间的信号进行分段积分，其中去除δ3.28 ～3.34 和δ4.66～5.10 之间的信号，以避免CHD2OD 和HOD 残留信号的干扰。将分段积分数据导入SIMCA-P 14.0 软件中进行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）。200 次重复排列置换检验（Permutation test）评价OPLS-DA 模型的准确性。使用OPLS-DA 模型的变量重要性投影（Variable important projection，VIP）对差异代谢物进行预选（VIP ＞1.0说明对分类有贡献）。对核磁共振图谱中未完全重叠的化合物信号通过积分（与TSP对比）进行单变量分析。

1.4 液相色谱分析

1.4.1 样品前处理采用GB5009.8-2016［16］方法对山药粉末进行提取以测定山药中糖的含量，采用GB5009.157-2016［17］方法对山药粉末进行提取以测定山药中柠檬酸和苹果酸的含量。

1.4.2 色谱测定条件糖含量测定：检测器：示差折光检测器；进样量：20 μL；流动相：乙腈∶水=75∶25（体积比），等度洗脱；流速：1.0 mL/min。有机酸含量测定：检测器：二极管阵列检测器；检测波长：210 nm；进样量：20 μL；流动相：0.1%磷酸溶液∶甲醇97.5∶2.5（体积比），等度洗脱；流速：0.8 mL/min。每个样品测试不少于3次。

2 结果与讨论

2.1 代谢物的鉴定

铁棍山药的1H NMR谱图如图1所示，利用文献数据［2，15，18-19］和对照品的1H NMR图谱，共指认30个化学成分，具体的特征化合物归属如表2 所示。对比前期研究中其他地区山药的核磁共振图谱，铁棍怀山药中少了葡萄糖和果糖信号的干扰，δ3.8 ～4.3 区间的丝氨酸、脯氨酸和苏氨酸的信号更加清晰可辨。

表2 山药主要代谢物的1H NMR图谱归属Table 2 Assignments of1H NMR spectral peaks obtained from yams

图1 山药提取物的1H NMR图谱Fig.1 1H NMR spectra of yam extracts 1-30 were the same as those shown in Table 2

2.2 差异代谢物的指认

2.2.1 PCA 分析PCA 分析属于无监督的模式识别方法，能够反映数据的原始状态，直观地显示不同样品间的整体差异。7 种铁棍山药的PCA 图（图2）显示第一主成分（PC1：56.0%，地域）和第二主成分（PC2：4.3%，土质）可以解释60.3%的原变量信息，不同产地的山药样本存在一定成分差异。温县、孟州、武陟的垆土和沙土山药能够通过PC2 分开，表明土质差异对山药的影响大于地域差异。7 种铁棍山药中，温县垆土和孟州垆土山药成分更接近，而孟州沙土和武陟沙土山药成分更接近。

图2 7种山药的PCA得分图Fig.2 PCA score plot of 7 yams

（续表2）

2.2.2 OPLS-DA 分析PCA 分析为无监督分析，可反映数据的原始状态，但不能消除组内误差和随机误差。而有监督的OPLS-DA 能够将与Y矩阵相关的X 矩阵和与Y 矩阵无关的X 矩阵加以区分，消除组内误差及与研究目的无关的随机误差，体现数据的整体特征和变化规律，使两组分类差别达到最大，从而确定两组之间的化学成分差异，提高模型的有效性和解析能力。

温县垆土铁棍山药和孟州垆土铁棍山药OPLS-DA 模 型（图3A）的R2X 为0.82，Q2为0.996，两者均大于0.5且接近于1，表明模型高度可靠。在柱状荷载图中（图3B），以VIP ＞1.0 作为标准，可知温县垆土山药中精氨酸、柠檬酸和天冬氨酸含量较高；孟州垆土山药中苏氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、蔗糖、苹果酸、尿囊素含量较高。200 次重复排列置换检验的R2为0.373，Q2为-0.626（图3C），表明模型不存在过度拟合。值得注意的是，载荷图中显示，温县垆土山药的葡萄糖、果糖含量均低于其他几种山药，但是所有载荷图中葡萄糖和果糖的VIP均小于1.0，并不是主要成分。

图3 温县垆土铁棍山药和孟州垆土铁棍山药的OPLS-DA得分图（A）、载荷图（B）和模型验证图（C）Fig.3 OPLS-DA score plot（A），loading plot（B）and permutation test（C）of WL vs. ML

其他5种山药与温县垆土山药OPLS-DA 模型的R2X、Q2以及置换检验的R2、Q2值均表明这几种山药的模型高度可靠，不存在过度拟合，相关数据列于表3。

表3 OPLS-DA模型质量的评价参数Table 3 Assessment parameters for the evaluation of OPLS-DA

2.2.3 代谢物相对含量比较以TSP为内标，对山药中各化学组分定量积分，应用Graph Prism 8.0对成分进行单变量分析。结果显示，7种铁棍山药中，温县垆土山药的精氨酸含量最高，孟州垆土山药的苏氨酸、谷氨酰胺含量最高，温县沙土山药的丙氨酸和苹果酸含量最高，武陟沙土山药的尿囊素含量最高。此外，温县垆土和孟州垆土山药还有最高含量的异亮氨酸、缬氨酸两种必需氨基酸。总体来看，相较于外地种植铁棍山药和外地品种［15］，7种铁棍山药的化学成分差异不明显，温县垆土山药和孟州垆土山药成分更为相似；3种沙土地的铁棍山药中2-羟基异丁酸的含量均高于垆土地山药。

2.3 差异代谢物含量的测定

前期研究发现［15］，温县垆土铁棍山药的葡萄糖、果糖含量均低于外地种植的铁棍山药、地方品种山药以及种植在温县地区的地方品种山药，且可以利用温县垆土铁棍山药葡萄糖含量极低的特点用显色剂进行鉴别。为了明确焦作各地区铁棍山药之间糖含量的差别，本文利用液相色谱测定了沁阳、武陟、温县、孟州4 地铁棍山药中葡萄糖、果糖和蔗糖的含量，同时测定了柠檬酸和苹果酸两种有机酸的含量，结果见表4。

表4 液相色谱测得的铁棍山药中果糖、葡萄糖、蔗糖及柠檬酸、苹果酸的含量Table 4 Contents of fructose，glucose，sucrose and citrate，malate in yams detected by HPLC （mean±SD，mg/g）

可以看出，焦作地区4 县种植的7 种铁棍山药中均未检出果糖和葡萄糖，蔗糖含量以温县垆土地铁棍山药最低，葡萄糖和果糖仍然可以作为鉴别道地铁棍山药的指标。温县垆土地铁棍山药的柠檬酸含量最高，孟州垆土地铁棍山药的柠檬酸含量最低，温县沙土地铁棍山药的苹果酸含量最高，与OPLS-DA 载荷图结果一致，表明核磁共振氢谱中的积分面积能够有效表达代谢物的含量趋势。

3 结 论

山药是常见的食药两用药材，种植于焦作地区武陟、沁阳、温县、孟州4 地的铁棍山药均属于道地药材“怀山药”。本文采用核磁共振结合多元统计分析对上述4 县7 种铁棍山药中的化学成分差异进行了比较。通过核磁共振氢谱共鉴定化合物30种，多元统计结果显示7种铁棍山药存在化学成分差异，但是明显小于外地种植铁棍山药和外地品种山药。7 种铁棍山药中，温县垆土铁棍山药和孟州垆土铁棍山药成分最为相似。此外，7 种铁棍山药中葡萄糖和果糖含量均小于2.0 mg/g，果糖和葡萄糖的含量、葡萄糖显色试剂等仍适用于道地山药的判别检测［20-21］，也可利用电致化学发光酶生物传感器检测葡萄糖含量进行判别［22-23］。后续将结合动物实验来验证道地山药和其他地区山药之间的疗效差异。