金-银双金属纳米簇@多壁碳纳米管-二氧化钛纳米材料为新型氧化还原探针构建电化学免疫传感器

黄小梅，邓 祥，邓子禾

（1.四川文理学院 化学化工学院，四川 达州 635000；2.四川省教育厅特色植物开发利用研究重点实验室，四川达州 635000；3.四川省高等学校绿色化学重点实验室，四川 自贡 643000；4.石河子大学 化学化工学院，新疆 石河子 832000）

糖类抗原19-9（CA19-9）是存在于血液循环的胃肠道肿瘤相关抗原［1］，有助于胰腺癌、大肠及直肠癌的诊断［2］，也是迄今报道的对胰腺癌敏感性最高的标志物。因此，灵敏和准确地测定人体内CA19-9肿瘤标志物的含量，对于早期疾病诊断发挥了非常重要的作用［3-4］。目前报道检测CA19-9的分析方法主要有酶联免疫法［5］、放射性免疫法［6］、化学发光免疫法［7］等。然而，这些方法存在检测时间长、准确度低、难以实现自动化等缺点［8］。电化学免疫传感器用于检测肿瘤标志物具有操作简单、成本低、灵敏度高、选择性好等优点，成为近年研究的热门领域［9-13］。

近年来，金属纳米团簇（NCs）以其独特的光学、电学和化学性质，以及低毒性等在电化学生物免疫传感器中得到了广泛关注［14-16］。特别是双金属纳米团簇表现出两个原子的协同效应和更优越的电子、光学和催化性能，比单金属纳米团簇引起了更多的研究兴趣［17-19］。但金属NCs 的小尺寸不利于进一步分离、纯化和固定，从而影响其应用范围。因此，将小尺寸的金属NCs 固定在比表面积较大的载体上成为了一项具有挑战性的研究。

半导体（如TiO2和SiO2）由于其低成本、无毒、大的比表面积和良好的生物相容性而被用于构建电化学生物传感器［20-22］，但差的导电性使其在电化学应用中受到限制。近年来，半导体和碳纳米管（CNTs）的结合对于提高半导体的导电性引起了人们的广泛关注。如Li 等［23］使用CNTs 作为轴向链条将半导体纳米晶TiO2串联形成独特的“珍珠项链”结构的纳米复合材料（CNTs-TiO2NPs），不仅提高了CNTs-TiO2NPs 的导电性，而且促进了纳米晶TiO2的分散性，增加了活性比表面积。因此，与纯TiO2相比，CNTs-TiO2NPs的活性显著提高。

受上述研究启发，本文首先采用微波方法合成了具有独特“珍珠项链”纳米结构的CNTs-TiO2NPs。随后，采用牛血清白蛋白（BSA）将CNTs-TiO2NPs功能化，以BSA作为稳定剂潜在地结合和还原Au离子和Ag离子，在表面原位生成Au-Ag双金属NCs。以制备的Au-Ag双金属纳米簇@CNTs-TiO2纳米复合材料（Au-Ag NCs@CNTs-TiO2NPs）作为一种新型氧化还原探针首次构建了可对CA19-9进行灵敏检测的电化学免疫传感器。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI 660D 电化学工作站（上海辰华有限公司）；S-4800 型号扫描电子显微镜（SEM，日本日立）；H-800 透射电子显微镜（TEM，日本日立）；ESCALAB-250X-射线光电子能谱仪（XPS，英国V.G 公司）；FCMCR-3C 常压微波合成反应仪（科瑞仪器有限公司）；三电极体系，铂电极为对电极，甘汞电极为参比电极，修饰的玻碳电极为工作电极（GCE，Φ=4 mm）。

胰腺癌肿瘤标志物抗原（CA19-9）和小鼠单克隆抗体（anti-CA19-9）（种类反应：人类；宿主/亚型：小鼠/IgG1，kappa；1 mg/mL，含0.09%叠氮化钠）、二抗（4 mg/mL）购于郑州博赛生物工程有限责任公司；氯化金（HAuCl4）购于Sigma 公司；多壁碳纳米管（CNTs）购于南京先锋纳米有限公司；硝酸银（AgNO3）、BSA（96%～99%）、壳聚糖（CS）、二甲亚砜（DMSO）和TiCl3溶液（15%）均购于四川科龙化学试剂有限公司；实验用水均为二次蒸馏水。

1.2 纳米材料的制备

1.2.1 Au-Fe3O4纳米颗粒的制备［24］：用水热法合成Fe3O4纳米颗粒，然后用L-半胱氨酸将表面氨基化，再以抗坏血酸为还原剂将氯金酸还原成金纳米颗粒（Au NPs），形成以Fe3O4纳米颗粒为核，Au NPs为壳的纳米颗粒（Au-Fe3O4NPs）。

1.2.2 CNTs-TiO2 NPs 的制备：CNTs-TiO2NPs 的制备根据文献稍作修改［23］，首先分别将20 mg CNTs 和18 mL DMSO 加入到50 mL 带聚四氟乙烯盖的三颈瓶中，超声分散30 min；随后，加入2 mL TiCl3溶液（15%），磁力搅拌10 min 使其混匀后，将三颈瓶置于单室微波合成系统中；然后通入氮气（N2），使反应在氮气氛中进行，以15°C/min的加热速率对其进行微波辐照加热至180°C，保持30 min。反应结束后，用凝结水将系统温度降至25 ℃，离心收集固体产物，分别用乙醇和水洗涤3次；在80°C烘箱中干燥3 h，即制得具有“珍珠项链”结构的CNTs-TiO2NPs。

1.2.3 Au-Ag NCs@ CNTs-TiO2 NPs的制备：用2 mL 3%BSA 对5 mg CNTs-TiO2NPs进行表面化学修饰，得到—SH 或—NH2基团功能化的CNTs-TiO2NPs。在剧烈搅拌下将2.0 mL HAuCl4（10 mmol/L）水溶液和1.0 mL 不同浓度AgNO3水溶液分别加入到2.0 mL BSA 官能化的CNTs-TiO2NPs 悬浊液中，10 min 后，加入0.2 mL 1 mol/L 的NaOH 溶液中，在37 ℃磁力搅拌反应12 h 后获得Au-Ag NCs@CNTs-TiO2NPs。离心清洗后，真空干燥储存备用。

1.2.4 Au-Ag NCs@ CNTs-TiO2 NPs/Ab2/BSA 生 物 耦 合 物 的 制 备：将100 μL 2.0 mg/mL 的CA19-9 二抗加入到2 mL 1 mg/mL 的Au-Ag NCs@CNTs-TiO2NPs 悬浊液中，在4 ℃磁力搅拌12 h。接着向上述悬浊液中加入200 μL 3%的BSA，在4 ℃搅拌反应2 h。离心并将二抗生物耦合物分散到0.1 mol/L PBS（pH 7.0）溶液中，置于4 ℃下保存。图1A 为Au-Ag NCs@CNTs-TiO2NPs/Ab2/BSA 生物耦合物的制备过程。

图1 免疫传感器的制备示意图Fig.1 Schematic diagram of the preparation of immunosensor

1.3 免疫传感器的制备

图1B 为免疫传感器的制备过程。将Au-Fe3O4NPs 通过超声分散于1 mg/mL CS 溶液中，形成均匀的Au-Fe3O4NPs-CS悬浮液（2.0 mg/mL）。取10 μL Au-Fe3O4NPs-CS滴涂于处理好的玻碳电极表面（GCE，Φ=4 mm），室温下晾干，制得Au-Fe3O4NPs-CS/GCE修饰电极。将Au-Fe3O4NPs-CS/GCE修饰电极浸在anti-CA19-9溶液中吸附12 h，冲洗表面未结合的抗体。将其浸入0.25%BSA溶液中以封闭非特异性结合位点。制备好的免疫传感器置于4 ℃备用。

1.4 测试方法与检测步骤

采用差分脉冲伏安法（DPV）和循环伏安法（CV）探讨传感器的响应性能。DPV的检测在含1.8 mmol/L H2O2的0.1 mol/L PBS（pH 7.0）溶液中进行，扫描电位为0.0～0.4 V，振幅为50 mV，脉冲宽度为5 ms。CV表征在5 mmol/L Fe（CN）63-/4-（pH 7.0）检测底液中进行，扫描电位为-0.2～0.6 V，扫描速率为50 mV/s。

检测步骤基于夹心免疫反应模式。在准备好的免疫传感器上滴加10 μL CA19-9标准样品，在4 ℃条件下孵育30 min 后冲洗；随后，将其孵育上具有氧化还原活性和放大作用的Au-Ag NCs@CNTs-TiO2NPs/Ab2/BSA 生物耦合物。一定条件下，在含有H2O2的底液中检测DPV 的电流变化值，即可测定抗原浓度。

2 结果与讨论

2.1 纳米材料的表征

从图2A 可以看出，Au NPs 均匀地分布于Fe3O4纳米颗粒表面，形成均一多孔结构的Au-Fe3O4NPs。在CNTs-TiO2NPs样品中，CNTs与TiO2纳米球串联连接，形成类似珍珠项链的结构（图2B）。当Au-Ag NCs 被原位还原时，由图2C 可见，许多Au-Ag NCs 聚集在CNT-TiO2NPs表面，表明Au-Ag NCs可以很好地吸附在TiO2纳米球上，这是由于TiO2纳米球与Au-Ag NCs 间的静电相互作用和氨基的高亲和性。XPS结果进一步证实该方法成功制得Au-Ag-NCs@CNTs-TiO2纳米颗粒（图2D）。

图2 Au-Fe3O4 NPs的扫描电子显微镜（SEM）图（A）、CNTs-TiO2NPs（B）、Au-Ag NCs@CNTs-TiO2 NPs（C）的透射电子显微镜（TEM）图及Au-Ag NCs@CNTs-TiO2 NPs的X射线光电子能谱（XPS）图（D）Fig.2 SEM image of Au-Fe3O4 NPs（A），TEM images of CNT-TiO2 NPs（B）and Au-Ag NCs@CNTs-TiO2 NPs（C），and XPS spectrum of Au-Ag NCs@CNTs-TiO2 NPs（D）

2.2 免疫传感器制备过程的循环伏安表征

采用CV表征免疫传感器的仿生界面的构建过程，由图3 所示，裸玻碳电极的循环伏安曲线呈现一对Fe（CN）63-/4-探针可逆的氧化还原峰（曲线a），当修饰上Au-Fe3O4NPs 和壳聚糖（CS）的悬浮液（Au-Fe3O4NPs-CS）后，CV 的响应信号显著增强（曲线b），可见Au-Fe3O4NPs 具有很好的电子传递性能。当抗体anti-CA19-9（曲线c）、BSA（曲线d）和抗原（曲线e）被依次固载于电极后，CV 的响应信号逐渐降低，这是因为其均为生物大分子，相互作用后，会逐步阻碍电子的传输。

图3 不同修饰电极在5 mmol/L Fe（CN）63-/4-（pH 7.0）溶液中的循环伏安图Fig.3 CV curves of different modified electrodes in 5 mmol/L Fe（CN）6 3-/4-（pH 7.0）solution a：bare GCE；b：Au-Fe3O4 NPs-CS/GCE；c：anti-CA19-9/Au-Fe3O4 NPs-CS/GCE；d：BSA/anti-CA19-9/Au-Fe3O4 NPs-CS/GCE；e：CA19-9/BSA/anti-CA19-9/Au-Fe3O4 NPs-CS/GCE

2.3 实验条件的优化

为了探究Au NCs和Ag NCs的协同作用，本实验测量了Au-Ag NCs@CNTs-TiO2NPs/Ab2/BSA 生物耦合物中不同摩尔比Au∶Ag的DPV电流响应信号。如图4A所示，Au-Ag NCs@ CNTs-TiO2NPs/Ab2/BSA 生物耦合物的响应强度明显高于Ag NCs@ CNTs-TiO2NPs/Ab2/BSA，表明Au-Ag NCs@ CNTs-TiO2NPs/Ab2/BSA 生物耦合物的DPV 电流信号强度与Au NCs 掺杂量有关。当Ag∶Au 的摩尔比为3∶1 时，Au-Ag NCs@CNTs-TiO2NPs/Ab2/BSA 生物耦合物的电流强度最大（约为单个Ag NCs的5倍），随着Au NCs比例的继续增加，电流强度增加缓慢，这可能是Au NCs和Ag NCs协同效应减弱的原因。当Ag∶Au的摩尔比为5∶1时，继续增大Au NCs比例，其电流强度则快速降低。

图4 偶合物中不同摩尔比Ag∶Au的电流响应强度（A），底液中H2O2浓度对免疫传感器反应信号的影响（B）Fig.4 Current intensities of the coupling with different molar ratios of Ag∶Au（A）and influence of H2O2 concentration on response signals of the immunosensor（B）all modified electrodes were incubated in 5 U/mL CA19-9 solution at 4°C for 30 min

在底液中加入适量H2O2可增强电流响应信号，提高检测灵敏度，因此对底液中H2O2含量进行优化。结果如图4B所示，当底液中H2O2浓度达到1.8 mmol/L后电流信号增加的趋势减小。本实验选择底液中H2O2的最佳浓度为1.8 mmol/L。

2.4 不同纳米材料催化性能的测定

为了考察纳米材料间的协同作用，比较了Au NCs@CNTs-TiO2NPs/Ab2/BSA、Ag NCs@ TiO2/Ab2/BSA、Au-Ag NCs@TiO2NPs/Ab2/BSA、Ag NCs@ CNTs-TiO2NPs/Ab2/BSA、Au-Ag NCs@ CNTs-TiO2NPs/Ab2/BSA 5 种纳米生物探针的DPV 信号及催化后的DPV 信号。由图5 可知，这些纳米生物探针中Ag NCs 作为氧化还原探针使传感器产生电化学信号。而Au NCs@ CNTs-TiO2NPs/Ab2/BSA中因无Ag NCs，导致无电化学信号（曲线a）。曲线b、c、d和e的电流响应信号依次增强。这主要归因于：在“珍珠项链”结构的Au-Ag NCs@ CNTs-TiO2NPs/Ab2/BSA纳米生物探针中，CNTs 作为轴向链条串联TiO2NPs，既提高了材料导电性，又提高了TiO2NPs 的分散度和比表面积活性，从而在TiO2NPs 活性比表面积原位还原更多的Au-Ag NCs。因此，相较于纯相TiO2表面原位还原Ag NCs 和Au-Ag NCs，Ag NCs@ CNTs-TiO2NPs/Ab2/BSA 和Au-Ag NCs@ CNTs-TiO2NPs/Ab2/BSA 的 电 化 学信号显著提高。由图可知Au-Ag NCs@CNTs-TiO2NPs/Ab2/BSA 的电化学信号最强，这是Au-NCs 和Ag-NCs 协同作用的结果。因此本实验选Au-Ag NCs@CNTs-TiO2NPs/Ab2/BSA为最终生物偶合物。

图5 不同纳米生物探针在含1.8 mmol/L H2O2的0.1 mol/L PBS（pH 7.0）测试底液中的电化学信号Fig.5 DPV reponses of different nanoprobes in 0.1 mol/L PBS（pH 7.0）containing 1.8 mmol/L H2O2 a：Au NCs@CNTs-TiO2 NPs/Ab2/BSA，b：Ag NCs@TiO2NPs/Ab2/BSA，c：Au-Ag NCs@TiO2 NPs/Ab2/BSA，d：Ag NCs@CNTs-TiO2 NPs/Ab2/BSA，e：Au-Ag NCs@CNTs-TiO2 NPs/Ab2/BSA，f：Au-Ag NCs@CNTs-TiO2 NPs/Ab2/BSA（without H2O2）

进一步考察Au-Ag NCs@CNTs-TiO2NPs/Ab2/BSA在底液未加入H2O2（曲线b）和加入H2O2后（曲线a）时的DPV响应曲线。结果显示，由于Au-Ag NCs@CNTs-TiO2NPs和Au-Fe3O4NPs均具有良好的模拟酶活性，协同催化H2O2，获得了较大的电化学信号。由此可知，在底液中加入H2O2可显著增强传感器的电流信号。

抗体的固载量直接影响检测灵敏度，因此抗体的固载基质非常重要。本实验分别以Au-Fe3O4NPs和Au NPs 为抗体的固载基质进行了考察。以Au-Fe3O4NPs 为一抗的固载基质的电流响应强度为251.31 μA，是Au NPs 为固载基质（82.19 μA）的3 倍多。这是因为，一方面，磁性纳米复合材料Au-Fe3O4NPs不仅具有普通复合纳米材料的性质，还具有超顺磁性、高矫顽力、低居里温度等特异的磁学性质［25-26］。另一方面，以Fe3O4NPs为核，Au NPs为壳的Au-Fe3O4NPs，增大了Au NPs的有效表面积，能固载更多的抗体。此外，Au-Fe3O4NPs所具有的模拟酶特性可以很好地催化底液中的H2O2，继而增强电流响应强度。因此，本实验选择Au-Fe3O4NPs 为一抗的固载基质。

2.5 免疫传感器对CA19-9的定量检测

在最佳实验条件下，用目标免疫传感器对不同浓度CA19-9 进行灵敏检测。结果如图6 所示，DPV 的电流信号随CA19-9 抗原浓度的增大而增强，表明随着CA19-9 抗原浓度的增加被捕获于电极表面的二抗生物探针也随之增加。由图6 插图可知，检测CA19-9 抗原的线性范围为0.01～200 U/mL，线性方程为I= 108.68 logc+258.46（r=0.996 2），最低检出限为0.003 U/mL。

图6 目标免疫传感器对不同浓度CA19-9的DPV电流响应Fig.6 DPV responses of the proposed immunosensor for different concentrations of CA19-9 concentration of CA19-9：0.01，0.1，1，5，10，20，100，200 U/mL；inset：the standard curve of an immunosensor for detection of CA19-9

2.6 免疫传感器的选择性、重现性与稳定性

为了研究免疫传感器的特异性，选择癌抗原15-3（CA15-3）、癌胚抗原（CEA）、癌抗原125（CA125）和甲胎蛋白（AFP）作为主要干扰因子。结果如图7 所示，与标准CA19-9 样品（5 U/mL）相比，CA15-3（20 U/mL）、CEA（20 U/mL）、CA125（20 U/mL）和AFP（20 U/mL）孵育前后的电流响应变化较弱。表明该免疫传感器对CA19-9的检测具有高选择性。

图7 电化学免疫传感器的选择性研究Fig.7 Study on the selectivity of the immunosensor

在同一条件下，使用5 支制备相同的电极对同一浓度的CA19-9（5 U/mL）平行测定以考察该免疫传感器的重现性。结果表明，5 支电极的电化学响应基本一致，相对标准偏差（RSD）为4.3%，重复性较好。将免疫传感器储存于4 ℃条件下间歇检测，一周后电流响应值下降到95.3%，20 d 后电流响应值也仅下降到89.4%。数据结果显示该传感器的稳定性较好。

2.7 生物样品的测试

在优化条件下，采用标准加入法测定免疫传感器的回收率。血清中CA19-9的实际浓度（29.06 U/mL）作为标准参考值。将健康人血清稀释50倍后，配制成不同浓度的CA19-9 标准样品，对其进行检测。由表可知，测得回收率为94.6%～105%，RSD为4.3%～6.5%，表明该免疫传感器有望用于临床血清样品中CA19-9的检测。

表1 免疫传感器测定人体血清中CA19-9的加标回收率Table 1 Spiked recoveries of CA19-9 in human serum determined by the immunosensor

3 结 论

本文首次合成了一种具有独特“珍珠项链”结构Au-Ag NCs@CNTs-TiO2NPs 纳米复合物为载体固载二抗，并将其直接作为信号标签构建高灵敏CA19-9 电化学免疫传感器。首先，将具有过氧化物模拟酶特性的磁性Au-Fe3O4NPs 用于修饰电极，以增加电极的有效面积，加快电极表面电子传递速率，同时有效催化底液中的H2O2以提高免疫传感器的响应信号。其次，Au-Ag NCs@CNTs-TiO2NPs纳米复合材料的特殊结构，不仅提高了电化学免疫传感器的导电性，也大大提高了生物分子的固载量，且表面的双金属纳米簇Au-Ag NCs可有效催化底液中的H2O2，进一步放大免疫传感器的电化学响应信号。最后，纳米材料间的协同催化作用也极大地放大了该免疫传感器的电化学响应信号。因此，该免疫传感器具有灵敏度高（最低检出限为0.003 U/mL）、检测范围宽（0.01～200 U/mL）等优点。