高效解磷根瘤菌菌株的分离筛选及对花榈木苗木生长的影响

陈晓琳，刘洁莹，宋艳琦，周洁尘，，汪 亮，段 翔，李学信，何苑皞

（1.中南林业科技大学 a.南方人工林病虫害防治国家林业和草原局重点实验室；b.森林有害生物防控湖南省重点实验室；c.经济林培育与保护教育部重点实验室，湖南 长沙 410004；2.湘潭市林业科学研究所，湖南 湘潭 411206）

花榈木Ormosia henryi又称花梨木，为豆目Fabales 蝶形花科Papilionaceae 红豆属Ormosia常绿乔木，是我国特有的珍贵用材树种，产于我国亚热带地区，自然分布于安徽、浙江、江西、湖南、湖北、广东、四川、贵州、云南9 个省份，海拔100～1 300 m 的山地、溪边和谷地林内[1]。花榈木树体高大，木材结构均匀，硬度适中，是制作高档家具、工艺雕刻和特种装饰品的珍贵高档用材树种；其根、茎、叶和树皮均可入药，具有通络、祛风湿、消肿痛等功能，也是一味重要的中药材[2]；其植株四季青翠，可作为优良的园林绿化树种。因此花榈木是集观赏价值和药用价值于一身的植物资源。由于花榈木具有十分高的利用价值，其野生种群大树遭到严重砍伐，且分布区狭窄，自然更新不良，导致其种群衰退濒临灭绝，使天然林资源已濒于枯竭[3]，被列为国家二级保护植物。目前，花榈木的人工培育以种子繁殖、组织培养和无性繁殖为主[4]。组织培养和无性繁殖技术虽然成活率较高，但对于花榈木种质资源的丰富及种群的延续并不利。采用种子繁殖有利于花榈木种群的延续及扩大，但种子繁殖的花榈木幼苗存在幼苗生长细弱，结瘤率低，上山造林成活率低的问题，因此如何提高结瘤率，提高种子幼苗保存率是目前亟待解决的问题。

根瘤菌是一种革兰氏阴性菌，主要存在于土壤中，菌体呈杆状，细胞的大小在（0.4～0.9）μm×（1.2～3.0）μm 范围内变化，周身、侧生或单鞭毛，能侵染大多数豆科植物形成共生固氮结构-根瘤。根瘤菌通过共生固氮作用将空气中游离态氮转变成植物可利用态氮，并且其所固定的氮素约占生物固氮总量的65%。根瘤菌与植物的共生固氮作用，在生态改良和农林牧业的可持续发展上有着非常广阔的应用前景。因为其不仅可以有效地改良土壤肥力，并且可以缓解因过度使用氮肥而造成的环境污染[5]。目前研究根瘤菌的研究主要集中在与豆科植物共生的机理，但一些林木也可与根瘤菌形成根瘤，例如花榈木、合欢Albizia julibrissin。等。花榈木可与根瘤菌共生，但在栽培过程中发现，人工播种的花榈木幼苗根瘤较少，幼苗长势不佳。目前对花榈木根瘤菌研究较少，主要集中在根瘤菌对植株的影响、根瘤菌种群多样性等方面。段如雁等[6-7]研究发现根瘤菌显著地促进了2年生花榈木的生长，对花榈木的叶绿素含量、硝态氮含量、硝酸还原酶活性、根系活力等生化指标影响极显著，同时还对花榈木根瘤菌多样性及系统发育进行了研究；安常蓉等[8]研究了花榈木根瘤接种的适宜方式，发现用萌发种子浸根和用菌液浇灌长出真叶后的幼苗效果最佳。前人的研究表明接种根瘤菌对提高种子幼苗存活率，促进苗木生长具有重要意义。

湖南土壤全磷含量低，是森林生态系统林木生长的关键限制因子之一，但依靠传统地施加磷肥，仅有不足20.0%的磷素最终被作物吸收，并不能解决土壤“缺磷”的问题[9]。由于土壤中的一些细菌或真菌具有溶解无机或有机磷化合物的能力，因此可利用这些解磷微生物提高土壤有效磷。本研究结合湖南土壤及花榈木种植的特点，筛选具有解磷能力的花榈木根瘤菌，同时研究其对花榈木实生苗生长的影响，可为提高花榈木种子繁殖存活率提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于湖南湘潭市林业科学研究所苗圃地（112°70.33′E，27°85.76′N），海拔71.13 m，属亚热带季风湿润气候，年平均降水量1 300 mm，年平均温度16.7～18.3℃。

1.2 花榈木根瘤的采集

试验样本分别于2020年6—11月采自湖南湘潭市林业科学研究所，挖取2～3年生长情况基本一致的野生花榈木，放入自封袋中，带回实验室于4℃冰箱保存，并尽快进行根瘤菌的分离培养。

1.3 培养基

蒙金娜培养基：葡萄糖10 g；硫酸铵0.5 g；氯化钠0.3 g；氯化钾0.3 g；七水硫酸亚铁0.03 g；四水硫酸锰0.03 g；碳酸钙5 g；酵母膏0.4 g；卵磷脂0.2 g；琼脂20 g；水1 000 mL；pH 值为7.0。

YMA 培养基：甘露醇10 g；磷酸氢二钾0.5 g；七水硫酸镁0.2 g；氯化钠0.2 g；酵母膏0.8 g；0.5%钼酸钠和硼酸各4 mL；琼脂20 g；水1 000 mL；pH 值7.0。

PKO 培养基：葡萄糖10 g；磷酸钙3 g；硫酸铵0.5 g；氯化钠0.1 g；七水硫酸镁0.1 g；氯化钾0.2 g；硫酸锰0.004 g；硫酸亚铁0.002 g；酵母膏0.5 g；琼脂20 g；水1 000 mL；pH 值为7.0。

NF 无氮营养液：二水氯化钙132 mg；磷酸二氢钾100 mg；磷酸氢二钠150 mg；七水硫酸镁120 mg；硼酸6.2 mg；五水合柠檬酸铁5 mg；四水硫酸锰0.17 mg；七水硫酸锌0.28 mg；六水氯化钴0.24 mg；五水硫酸铜0.025 mg；二水钼酸钠0.024 mg；水1 000 mL；pH 值为6.5。

1.4 花榈木根瘤菌的分离纯化

从采回的花榈木根系上选取个大、饱满、新鲜的根瘤，首先用自来水冲去表面泥土，然后再用无菌水洗涤干净。在无菌条件下，用75%的乙醇溶液浸泡5 min，无菌水冲洗3 次后，接着用0.1%氯化汞溶液消毒5 min，再用无菌水冲洗7～8 次。然后将取部分根瘤放于灭菌的研钵中，用研钵将其压碎，并取汁液接种于YMA 固体培养基上。随后，在灭菌的载玻片上将另一部分根瘤切成两半，然后用无菌镊子夹住其中半个瘤，切面向下并在YMA 固体培养基表面划线，然后全部倒置后在28℃条件下培养大约5 d，随时观察生长状况。吸取最后一次冲洗的无菌水100 μL 于YMA 固体培养基涂布培养，作为对照。菌体长出后，进行分离纯化，直至获得单菌落。取单菌落，然后接入试管斜面中于4℃冰箱保藏备用。

1.5 花榈木根瘤菌解磷能力的测定

将10 μL 根瘤菌培养液点接种于蒙金娜培养基和PKO 培养基正中央，待风干后盖好，28℃培养96 h，得到产生透明圈的解磷菌纯菌落，并测量记录透明圈直径(D)，斜面保藏备用。

测定有效磷的含量运用钼锑抗比色法。将1 mL（1×108cfu·mL-1）菌种接入 50 mL 灭菌的液体培养基中，28 ℃ 160 r·min-1在摇床上培养2 d。取适量菌液，在4℃ 10 000 r·min-1条件下离心20 min，吸取上清液于容量瓶中，用水稀释至20 mL，加入2,6-二硝基酚指示剂2 滴，调节pH 值至溶液呈微黄色，然后加入钼锑抗显色剂5 mL，摇匀、定容至刻度线。在室温下放置30 min，用分光光度计在波长700 nm 下比色，以空白为参比液调零点。读取数值，在标准曲线上查出显色液磷的读数。

溶磷量=[(显色液磷的读数×显色液体积×分取倍数)/(W×109)]×100；W：每个锥形瓶发酵液中加入有机或无机磷化物的质量（g）。

1.6 根瘤菌回接试验

将分离得到的纯菌落分别挑取接种到100 mL YMA 液体培养基中，在28℃、150 r·min-1条件下的恒温摇床培养36 h，待用。

花榈木种子用75%乙醇溶液处理15 min 和0.1%氯化汞进行表面消毒后，用无菌水冲洗7～8次。将处理后的种子，放于灭菌后的组培瓶中，在25℃条件下的人工气候箱内进行催芽。发芽后将其浸泡于根瘤菌缓冲液中2 h，然后将处理过的幼苗置于无氮营养液NF 琼脂培养基中于人工气候箱内培养观察。培养条件：25℃光照16 h，20℃黑暗8 h，并且根部保持黑暗。当花榈木幼苗长至超过试管口时，引苗出口，在培养过程需要及时补充NF 营养液，定期观察结瘤情况，90 d 后收集根瘤。以不接种根瘤菌的花榈木幼苗为对照，采用目测统计根瘤数目。固氮酶活性测定采用乙炔还原法[10]。

固氮酶活(nmol·mg-1·h-1))：U=n/(m·t)。式中：U表示根瘤固氮酶活（nmol·mg-1·h-1）；n表示乙烯含量（nmol）；m表示根瘤鲜质量（mg）；t表示反应时间（h）。

1.7 根瘤菌对花榈木生长影响的测定

选取10 株结瘤数目较多，固氮酶活性较高的根瘤菌继续后期实验。花榈木幼苗长出真叶时用根瘤菌液浇灌根部，培养7 个月后，采用直尺测量的方式测定花榈木主干生长高度，主干直径。植株洗净擦干后于105℃烘箱中杀青30 min，再调至80℃烘干恒质量并称量干质量。采用SPAD-502叶绿素仪测定叶绿素含量[11]、植株全氮量的测定采用凯氏定氮法[12]。

全氮含量(g·kg-1)：W=［c(V2-V1)×0.014］/［m(V3/V)］×1 000。式中：W表示植株全氮含量（g·kg-1）；c表示硫酸标准溶液的浓度0.01 moL·L-1；V1表示空白滴定消耗标准液量（mL）；V2表示试剂滴定消耗标准液量（mL）；V3表示上机测试液量10 mL；m表示样品质量（g）；V表示消煮后定容液100 mL；0.014 表示氮的毫摩尔质量（g·mmol-1）。

1.8 数据处理

本试验采用 Microsoft Excel 2016 软件对所有数据进行整理、分析、统计；利用IBM SPSS Statistics 17.0 统计软件对数据进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 根瘤菌的分离纯化及形态

从花榈木根瘤中分离到根瘤菌株20 株。菌落基本呈圆形、椭圆形，2～7 d 开始长出菌落，菌落直径1.7～5 mm，乳白色或半透明，菌落表面凸起，边缘整齐，产生黏液，具光泽。革兰氏染色阴性，光学显微镜下观察到菌体为杆状或棒槌状，平均大小为(2.98±0.54) µm×(0.58±0.60) µm。

2.2 花榈木根瘤菌解磷能力的测定

将分离到的20 株花榈木根瘤菌接种在解磷固体培养基上，培养96 h 后测量解磷圈大小，初步判断菌株的解磷能力。由表1可看出，具有解无机磷能力的固氮菌有8 株，具有解有机磷能力的固氮菌有14 株，具有同时分解无机磷和有机磷的菌株有8 株，分别为XT202001、XT202006、XT202010、XT202011、XT202014、XT202016、XT202019、XT202020。菌株XT202016 的解磷能力最强，无机磷和有机磷的透明圈直径，分别为2.22±0.2 和4.91±0.05 mm，无机磷和有机磷的溶磷量分别为31.1±0.3 和71.2±0.6 mg·L-1。

2.3 回接根瘤菌对花榈木结瘤的影响

本研究将根瘤菌分别回接于花榈木幼苗上，对根瘤数目和固氮酶活性进行了统计，其目的是为了鉴定上述根瘤菌的共生结瘤和固氮能力。结果如表2所示，所分离的根瘤菌能与花榈木共生形成根瘤，而不接种处理的花榈木（CK）则不能形成根瘤。根瘤菌接种花榈木后根瘤数量在30 个以上的有XT202016、XT202012、XT202007，数量分别为39、33、31 个。

表1 不同根瘤菌菌株的解磷能力†Table 1 Phosphate solubilizing ability of different rhizobium strains

表2 回接不同根瘤菌对花榈木结瘤及固氮的影响Table 2 Effects of inoculation with different rhizobium strains on nodulation and nitrogen fixation in O.henryi

根瘤固氮酶活性是衡量根瘤菌固氮能力的重要指标[13]。固氮酶活性最高的为菌株XT202016，值为2.54 µmol·g-1·h-1，其次为XT202004，固氮酶活性为1.34 µmol·g-1·h-1。从表2中可以看出根瘤数量较多的菌株其固氮酶活性也较高。

2.4 回接根瘤菌对花榈木生长的影响

从表3可以看出，将回接处理7 个月后的幼苗，与不接种根瘤菌的幼苗进行对照相比。接种了根瘤菌的花榈木在株高、地径和植株干质量方面均增加，其中接种了XT202016 的植株增加最为明显，株高、地径和植株干质量分别为0.77 m、1.58 mm、0.525 g，与CK 对照相比分别增加了92.5%、22.5%、35.0%，表明通过接种根瘤菌明显促进了植株的生长发育（表3）。

表3 回接不同根瘤菌对花榈木生长的影响Table 3 Effects of inoculation with different rhizobium strains on the growth of O.henryi

叶绿素含量高低可以影响植物光合作用。接种根瘤菌的花榈木植株叶绿素含量和氮含量明显高于对照。其中接种菌株XT202014 和XT202016的叶绿素含量显著高于其他植株，且对应的植株全氮含量也最高。说明接种上述2 株根瘤菌更能显著促提高植株叶绿素含量和氮含量。

3 结 论

花榈木属于豆目植物，可与根瘤菌共生固氮，但人工培育的花榈木幼苗结瘤率低，生长缓慢[5]。本研究从野生花榈木的根瘤中分离筛选了20 株根瘤菌，测定了其解磷能力、结瘤能力及固氮酶活性，并从中选取了解磷、结瘤和固氮酶活性较高的10 株根瘤菌，测定了其对花榈木生长的影响，结果表明接种根瘤菌后可明显提高植株的株高、地径、干质量、叶绿素含量及含氮量。花榈木根瘤菌落基本呈圆形、椭圆形，2～7 d开始长出菌落，菌落直径1.7～5 mm，乳白色或半透明，菌落表面凸起，边缘整齐，产生粘液，并具光泽。革兰氏染色为阴性，菌体为杆状或棒槌状。其中菌株XT202016 解磷、结瘤能力较强，固氮酶活性较高，同时对花榈木生长的促进作用也较为明显。

4 讨 论

南方地区淋溶强烈，土壤富含铝离子和铁离子，磷极易被固定[14]，有效磷缺乏是一种非常普遍的现象[15]。林木种植时虽然施用了大量磷肥，但最终被作物吸收磷素不足20.0%，其余的被化合沉淀、吸附或形成闭蓄态磷而无法被植物吸收利用成为利用率极低的难溶性磷[16]。自然界中存在一些微生物可以不同程度地将土壤中的难溶性磷转化为植物可以吸收利用的有效磷。通常在外界缺磷的情况下，解磷微生物才会增加自身次生代谢物的分泌，从而产生解磷作用[17]。Chungopast等[18]研究发现溶磷菌（PSB）的应用可以解决土壤中的固磷问题，同时PSB 还具有提高盆栽甘蔗Saccharum officinarum栽培产量的能力。杨豆等[19]在毛竹根际分离出解磷细菌B.lata PN1 用于石灰岩土壤中，该菌株具有能适用于南方丘陵山区酸性土壤竹林的环境友好型菌肥的潜力。根瘤菌虽然在共生体阶段难以与外界土壤接触，不能发挥其解磷作用，但在根瘤形成前或根瘤衰败破裂后根瘤菌是以游离状态存在于土壤之中，因此根瘤菌也可作为根际促生菌发挥解磷促生的作用[20]。李剑锋等[21]的研究也表明，解磷根瘤菌能有效缓解植物在仅提供难溶性无机磷的环境中受到的缺磷胁迫，并使之恢复正常生长。韩梅等[22]在大豆上分离筛选到1 株兼具有结瘤固氮和解磷作用的根瘤菌，其固氮酶活性为4.94 μmol·g-1，解磷量在第7 天为35.50 μg·mL-1。本研究从花榈木根瘤菌中筛选了具有解磷特性的菌株，但所筛菌株的解磷能力并不是很强，特别是解无机磷的能力，可以通过诱变育种提高解磷能力。同时本研究并未对菌株的解磷能力进行实时监测，因此菌株的解磷能力随着时间的推移可能存在一定的变化。

对于结瘤的豆科植物来说，结瘤的多少代表苗木质量的优劣。根瘤菌能不同程度地促进其苗木的生长，且结瘤率与幼苗的株高、地径、生物量之间存在着明显的正相关性。根瘤菌对其他科的植物也具有同样的作用，曾电源等[23]将合欢幼苗接种根瘤菌后，经过研究发现根瘤菌不仅可以促进合欢幼苗根系和叶片的生长，并且还可以缓解Cd 胁迫对根系生长、叶片发育的抑制作用。黄宝灵等[24]将根瘤菌接种马占相思Acacia mangium苗木，苗木的生物量和叶片含氮量显著提高，同时还可显著的增加土壤氮素含量及迅速降低土壤的含磷量。本研究研究结果与前人基本一致，表明根瘤菌可促进花榈木苗木的生长，提高叶绿素含量，同时提高植物氮含量。

本研究中仅对根瘤菌的溶磷性能进行了测定，未对其溶磷的机理及施用后土壤中的磷元素的变化情况进行探讨，存在一定的局限性，后续可以对相关问题进行深入研究。同时本研究在接种根瘤菌时只采用了一种接种方式，有研究表明不同的接种方式对花榈木结瘤具有显著的差异[8]，因此还可以继续研究不同接种方式对花榈木结瘤及生长的影响。