血清miR-499-5p、铁调素20联合检测在急性心肌梗死诊断中的应用*

周 云，镇海涛，郭 芬，李 军,魏家兴,彭艺灵

湖北科技学院医学部国家级全科医学实验教学示范中心，湖北咸宁 437100

急性心肌梗死(AMI)是由心肌持续性缺血所致的急性组织坏死，具有极高的发病率和死亡率[1]。微小RNA(miRNA)是非编码RNA分子，在血液和组织中均能稳定表达，对脂类代谢及染色体重构等过程均具有调控作用[2]。miR-499-5p主要在哺乳动物的心肌和骨骼肌中高度表达，正常生理条件下机体血清中的miR-499-5p水平较低[2]。ZHOU等[3]发现，miR-499-5p能够作用于多种心肌细胞特征性基因靶点，从而调控心肌细胞的凋亡、增生及分化等过程。铁调素(Hepc)是一种由肝脏合成的抗菌多肽，由25个氨基酸组成，对机体内铁离子的稳定具有关键的调节作用[4]。HAN等[5]发现，炎性反应能够刺激机体释放大量的白细胞介素-6(IL-6)进入血液循环，从而促进Hepc-20合成。因此，本研究旨在探讨miR-499-5p和Hepc-20联合检测对AMI的诊断价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2020年6月至2021年6月于本中心收治的AMI患者96例作为AMI组，并根据心电图ST段是否抬高将其分为ST抬高型心肌梗死(STEMI)组(48例)和非ST抬高型心肌梗死(NSTEMI)组(48例)。同时，选取同年龄段的心绞痛患者及健康者各96例，作为心绞痛组和健康组。纳入标准：(1)AMI组符合文献[6]中对AMI的诊断标准，且均经冠脉造影证实；(2)无心肌梗死既往史；(3)相关实验室检查及基本资料完整；(4)从发病到入院抢救的时间不超过6 h。排除标准：(1)合并慢性心力衰竭；(2)两周内服用过铁剂或接受了输血治疗；(3)合并其他恶性肿瘤(如白血病、恶性淋巴瘤及肾癌等)；(4)合并心脏瓣膜疾病、急性心肌炎及心肌病等严重心脏疾病；(5)合并凝血功能障碍。本研究经本中心医学伦理委员会批准，且所有受试者或其家属均签署知情同意书。

1.2标本采集 所有受试者均于肘静脉处抽取10 mL静脉血置于抗凝管中，通过离心机(生产厂家：山东博科科学仪器有限公司；型号：TD-6M)以6 000 r/min离心5 min，取其上层清液置于试管中，于-80 ℃冰箱中保存。

1.3检测方法 采用miRNA分离试剂盒(美国Invitrogen公司，批号：20200513)提取总RNA，严格遵循试剂盒的操作规定。将提取的总RNA滴入20 μL无核糖核酸酶的水中溶解，通过紫外分光光度仪(美国Promega公司)检测A260值和A280值，计算其RNA的纯度和浓度，选取A260/A280比值在1.8～2.0的标本用于后续试验。利用HG TaqMan miRNA试剂盒(新海基因检测有限公司，批号：20200526)将总RNA反转录为cDNA。通过SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒(购自德国Qiagen公司，批号：20200516)定量检测miR-499-5p的表达量。miR-499-5p的反应条件均为16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。PCR扩增体系为：SYBR Premix 10 μL、cDNA标本3.0 μL、ddH2O 5.0 μL、正向引物1.0 μL及反向引物1.0 μL，共计20 μL。miR-499-5p的正向引物序列为5′-CGT GTC GAC CAA GTC TGG GGT GAA AGA GAA G-3′、反向引物序列为5′-TGT GTC GAC GGT CAT GAG CTT GTT GAG GTT C-3′。内参基因U6的正向引物序列为5′-ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT-3′、反向引物序列为5′-GGA ACG CTT CAC GAA TTT G-3′。miR-499-5p的PCR反应条件均为预变性95 ℃ 20 s、变性95 ℃ 20 s、退火60 ℃ 30 s、延伸70 ℃ 5 s，扩增40个循环。每个标本设置3个复孔。引物序列由苏州瑞博生物技术股份有限公司合成。以相对Ct值法检测miR-499-5p的相对表达水平，相对于U6的比值为2-ΔΔCt，以ΔCt值为结果，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因。

总胆固醇(TC)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)、高密度脂蛋白(HDL)、三酰甘油(TG)、血肌酐(Cr)及低密度脂蛋白(LDL)采用全自动生化分析仪(瑞士罗氏公司，型号：COBAS INTEGRA 800)检测。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中Hepc-20水平，严格遵守试剂盒(上海古朵生物科技有限公司，批号：20200522)流程操作，其中线性范围为12.5～300.0 μg/L。

2 结 果

2.13组受试者的一般资料 AMI组血清中的miR-499-5p、Hepc-20、cTnI、LDL水平较心绞痛组和健康组升高(P<0.05)；AMI组血清中的HDL水平较心绞痛组和健康组降低(P<0.05)；AMI组和心绞痛组TG水平较健康组升高(P<0.05)。见表1。

表1 3组受试者的一般资料[n/n或或n(%)]

组别nHDL(mmol/L)TG(mmol/L)TC(mmol/L)Cr(μmol/L)cTnI(μg/L)miR-499-5pHepc-20(μg/L)AMI组961.03±0.24ab1.98±0.95a4.23±1.8583.52±33.164.23±1.96ab1.37±0.25ab94.66±21.23ab心绞痛组961.66±0.31a1.85±0.86a4.12±1.9966.03±31.051.33±0.51a0.95±0.18a63.21±16.99a健康组963.16±1.251.56±0.724.01±1.9271.39±35.661.16±0.420.69±0.2222.06±6.78

2.2STEMI和NSTEMI组患者血清miR-499-5p和Hepc-20水平比较 两组血清中的miR-499-5p和Hepc-20水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 STEMI和NSTEMI组患者血清miR-499-5p和Hepc-20水平比较

2.3二元Logistic回归模型分析发生AMI的独立影响因素 二元Logistic回归分析结果显示，miR-499-5p、Hepc-20、cTnI及LDL水平升高是影响AMI发生的独立危险因素(P均<0.05)，见表3。

表3 二元Logistic回归模型分析发生AMI的独立影响因素

2.4AMI患者血清中miR-499-5p和Hepc-20与cTnI的相关性分析 miR-499-5p和Hepc-20均与cTnI呈正相关(r=0.746、0.871，P<0.05)。

2.5血清中miR-499-5p、Hepc-20对AMI的诊断效能 将AMI组和心绞痛组作为分析对象，以是否发生AMI为前提绘制ROC曲线，miR-499-5p和Hepc-20的最佳截断值分别为1.27、90.00 μg/L，miR-499-5p和Hepc-20的曲线下面积(AUC)分别为0.806、0.838。miR-499-5p和Hepc-20联合检测的AUC为0.877，明显大于miR-499-5p或Hepc-20单项检测的AUC，联合检测的灵敏度和特异度分别为90.24%、78.05%，见表4、图1。

表4 血清中miR-499-5p、Hepc-20对AMI的诊断效能

图1 血清中miR-499-5p、Hepc-20诊断AMI的ROC曲线

3 讨 论

AMI是冠心病最严重的结果，据流行病学统计，世界范围内每年因AMI死亡人数已达3 000 000～4 000 000，且呈不断上升的趋势[1]。人口老龄化、饮食结构的改变及遗传易感性是导致AMI的重要因素。虽然冠状动脉造影对确诊AMI具有重要意义，但其在临床实践中受诸多限制，且属于有创操作。目前，cTnI是诊断AMI最常用的生化指标，其对心脏损伤的灵敏度和特异度均较高，但终末期肾脏疾病或肾损伤也会导致cTnI水平升高，影响结果准确度[7]。同时，cTnI通常在AMI发生后的4～8 h才升高，且在12～24 h才能达到峰值，这不利于AMI早期诊断，使再灌注治疗的间隔延长，增加患者的死亡风险[7]。因此，cTnI的实际应用存在一定弊端，需要更多有效指标辅助诊断AMI。

miRNA属于内源性小RNA分子，不能编码RNA，其长度为21～26个核苷酸，能结合靶基因的3′-非翻译区(3′-UTR)，从而影响转录后的分子活动。体内循环血液中miRNA的分子长度较短，并具有抗酸、抗碱及抗RNA酶的能力，使其能够稳定存在于血液中[2]。miR-499-5p属于肌球蛋白Myh7b家族，在心肌细胞的外泌体中分泌较多，对心肌细胞凋亡、心肌纤维化及心室重构具有重要的调控作用，与心血管疾病关系密切[2]。动物实验表明，在家兔模型中，阻遏miR-499-5p表达能够提高心肌细胞中线粒体膜的稳定程度，延缓家兔心脏重构过程[8]。李世樱等[9]发现，导入miR-499-5p抑制剂后，受损的心肌细胞膜电位逐渐恢复，房颤诱发率明显下降。研究表明，miR-499-5p高表达能够降低心肌细胞对应激刺激的敏感性，导致心脏压力超负荷，心肌细胞受损，诱导小鼠出现严重的心功能不全[10]。本研究结果显示，AMI组血清miR-499-5p相对表达水平较心绞痛组和健康组升高(P均<0.05)。其原因可能是心肌细胞损伤、坏死后，细胞破裂，使其内外泌体合成并存储的大量miR-499-5p释放入血，导致AMI患者血清miR-499-5p相对表达水平升高[9]。Hepc的基因位于19号染色体上，由2个内含子和3个外显子组成，其中Hepc由第3个外显子编码。Hepc分为Hepc-20、Hepc-22、Hepc-25，其中Hepc-20和Hepc-25属于同一基因的异构体[5]。Hepc-20主要存在于血液和尿液中，包含2条β链，以二硫键的连接方式形成稳固的阶梯状结构[5]。研究表明，肝细胞在合成促红细胞生成素(EPO)时，机体内红细胞含量增加，这能够使肝脏合成Hepc-20的过程受阻[11]。心肌细胞外的过量铁离子能够激活氧化应激反应，从而释放活性氧(ROS)，增加心肌损伤的易感性[12]。本研究结果显示，AMI组血清Hepc-20水平较心绞痛组和健康组升高(P均<0.05)。其原因可能是发生AMI时，机体因免疫系统的作用能够诱导巨噬细胞、中性粒细胞分化，从而释放大量的炎症因子和趋化因子，促进Hepc-20合成增加并释放入血[13]。

cTnI是一种与心肌肌肉收缩相关的调节蛋白，是临床诊断心肌损伤最常用的生化指标，其在健康人体血清中水平较低，但当发生心肌细胞损伤时，其水平会升高[7]。LDL是一种运载胆固醇的脂蛋白颗粒，当其过量时会使胆固醇堆积在冠状动脉血管壁上，造成冠状动脉痉挛[14]。二元Logistic回归分析显示，miR-499-5p、Hepc-20、cTnI及LDL水平升高是影响AMI发生的独立危险因素(P均<0.05)，提示血清中miR-499-5p、Hepc-20、cTnI及LDL的水平对AMI的发生至关重要，可能成为筛查AMI的潜在生化指标。而STEMI和NSTEMI患者血清miR-499-5p和Hepc-20水平比较，差异无统计学意义(P均>0.05)，提示miR-499-5p和Hepc-20只能反映AMI可能存在，但无法判别AMI的具体类别。miR-499-5p和Hepc-20均与cTnI呈正相关(P均<0.05)，提示miR-499-5p、Hepc-20与临床常用指标cTnI具有较好的一致性。其原因可能是miR-499-5p高表达时，能够抑制肌球蛋白重链表达，降低心肌氧代谢和耐受性，使心肌损伤风险增加，这与cTnI的作用具有相似性，二者之间可能存在协同作用[3,15]。Hepc-20与cTnI之间存在的具体作用机制目前尚不清楚，需要后续基础实验进一步研究，但可能与AMI诱导的机体炎性反应使Hepc-20水平升高，同时心肌细胞溶解后释放cTnI入血有关[13,16]。ROC曲线结果显示，miR-499-5p联合Hepc-20检测的AUC明显高于miR-499-5p或Hepc-20单项检测的AUC，其灵敏度和特异度分别为90.24%和78.05%(P<0.05)，提示miR-499-5p和Hepc-20联合检测能够提高对AMI的鉴别诊断价值，且灵敏度和特异度均较高，对于区别心绞痛和AMI具有重要的临床意义。本研究结果显示，miR-499-5p联合Hepc-20检测的灵敏度较单项检测明显提高，提示二者联合对早期筛查AMI具有较高价值。

AMI患者血清中miR-499-5p和Hepc-20水平均升高，且是AMI发生的独立危险因素。在辅助诊断AMI时，miR-499-5p、Hepc-20与临床常用指标cTnI具有较好的一致性。miR-499-5p联合Hepc-20检测对AMI具有良好的诊断效能，且诊断的真实性可靠，为临床实施进一步治疗提供有利支持。但AMI患者血清中miR-499-5p和Hepc-20水平变化的具体机制尚不清楚，需要在接下来的研究中逐步证实。