过敏性鼻炎患者外周血CDCA5、HLA-DPB1、IL-23水平差异及意义研究*

黄 辉，蒋劲松，周明朗，代国胜，冀庆军，何 苗，柴 伟，孙敬武

1.亳州市人民医院耳鼻咽喉头颈外科，安徽亳州 236800；2.中国科学技术大学附属第一医院/安徽省立医院，安徽合肥 230032

过敏性鼻炎(AR)是临床中较为常见的严重变态反应性鼻炎，一般情况下AR多指外界刺激机体后导致机体出现过敏原感应性增高的应激反应，在临床中主要表现为鼻黏膜病变[1]。有研究指出，AR的临床发病率呈现明显上升趋势，且临床中多表现为鼻塞、鼻炎及连续性喷嚏[2]。虽然 AR对患者生命无法造成威胁，但由于其根治难度大且反复发作，严重影响患者生活质量[3]。因此，寻找AR患者发病的影响因素，对其制订针对性干预措施以降低AR发病率和改善患者临床症状具有重要意义。有研究表明，多类细胞及因子参与AR的发展，其中一类细胞的失衡为主要因素，这类细胞有嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞等，由于这类细胞产生的炎性因子，导致呼吸道慢性炎症发生[4]。有研究发现，细胞分裂周期相关蛋白5(CDCA5)在哮喘患者表达水平增高[5]，但CDCA5表达水平与AR关系鲜见报道。人类白细胞抗原(HLA)是人类免疫系统的重要组成部分，具有高度的多态性，是免疫遗传学研究的重要组成部分。早期研究显示，HLA基因多态性与AR发病有一定相关性[6]。细胞白细胞介素-23(IL-23)在Th17细胞的分化中具有重要作用，IL-23-Th17与多种疾病的发生相关，如关节炎、鼻窦炎、鼻息肉等[7-10]，但目前关于IL-23水平与AR的研究报道较少。笔者选取AR患者和健康者外周血单个核细胞，进行CDCA5、HLA-DPB1差异表达基因分析及IL-23血清水平差异分析，以期探讨外周血CDCA5、HLA-DPB1、IL-23表达水平与AR发病的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集亳州市人民医院耳鼻喉科AR患者52例作为病例组，其中男33例，女19例；年龄22～63岁；鼻炎病程2～10年；伴哮喘13例；有AR家族史15例；工作环境：室内28例，室外24例。另选取同期36例体检健康者作为对照组，其中男22例，女14例；年龄20～60岁；工作环境：室内21例，室外15例。两组年龄、性别、工作环境比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。纳入标准：(1)病例组：由亳州市人民医院医生根据《变应性鼻炎诊断和治疗指南(2015年，天津)》[11]AR诊断标准确诊为AR患者；(2)对照组：无呼吸道相关疾病,无过敏性疾病如鼻窦炎、皮炎等。排除标准：存在糖尿病、肝肾功能不全、免疫缺陷疾病或营养不良。根据《变应性鼻炎诊断和治疗指南(2015年，天津)》[11]将患者分为轻度组(间断性鼻痒、打喷嚏3～5个/次)、中度组(鼻痒频繁但能忍受，打喷嚏>5～10个/次，出现间断性鼻塞)、重度组(出现蚁行感鼻痒，打喷嚏>10个/次，鼻子堵塞严重)。

1.2方法

1.2.1外周血淋巴细胞分离 取2 mL外周血，新鲜肝素抗凝血加入等体积磷酸盐缓冲液混匀后，滴加细胞分离液，使用离心机2 000 r/min，离心20 min。管内层次分明，第2层为淋巴细胞层，取出第2层加入生理盐水混匀后，离心20 min，得到淋巴细胞。

1.2.2实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测CDCA5 mRNA相对表达水平 提取细胞总RNA并进行反转录为cDNA，按照试剂盒操作说明进行，所需引物序列为：CDCA5上游引物5′-CTC CAA ACT CAC CGA GGT CC-3′，CDCA5下游引物5′-GCA GCT TCA AAC TCG GCA TT-3；GAPDH上游引物5′-CCT GCA CCA CCA ACT GCT TA-3′，GAPDH下游引物5′-AGT GAT GGC ATG GAC TGT GG-3′。每个样本3个复孔，并绘制溶解曲线，计算ΔCT值。

1.2.3HLA-DPB1基因分型 取血液2 mL，用试剂盒提取样品基因组DNA。PCR-SBT为主的分型方法对HLA-DPB1基因进行DNA序列测定和等位基因分型。DPBl序列特异性引物是参考文献[12]的方法设计合成的。

1.2.4血清IL-23及IgE检测 通过双抗体夹心-酶联免疫吸附试验对血清IL-23水平进行测定。通过酶联免疫吸附试验检测IgE水平，根据操作说明进行检测。

2 结 果

2.1两组CDCA5 mRNA相对表达水平比较 对照组CDCA5 mRNA相对表达水平为1.25±0.12，病例组为1.62±0.16，两组比较差异有统计学意义(t=2.49，P<0.05)，见图1。进一步以CDCA5 mRNA相对表达水平的中位数为界值，分析CDCA5 mRNA相对表达水平高低不同者患AR的概率，结果显示，CDCA5高表达组患AR的比例为95.4%，明显高于CDCA5低表达组(5.89%)(P<0.05)。

图1 两组CDCA5相对表达水平比较

2.2两组HLA-DPB1基因分型比较 检测020102、0202、040101、0501、0502、0602、0901、13010902 8种HLA-DPB1等位基因，检测结果符合Hadry-Weinberg平衡。HLA-DPB1*0502和HLA-DPBI*040101在病例组和对照组中频率比较差异有统计学意义(χ2=6.63，P<0.05)，见表1。经Logistic回归分析发现，HLA-DPBI*040101基因(OR=0.48，95%CI=0.300～1.555)、HLA-DPB1*0502基因(OR=0.57，95%CI=0.040～0.934)提升了患AR的风险。

表1 HLA-DPB1等位基因分布比较[n(%)]

2.3两组血清IL-23和IgE水平比较 与对照组比较，病例组IL-23、IgE水平升高(P<0.05)。见表2。AR患者血清IL-23水平和血清总IgE水平呈正相关(r=0.479，P<0．001)，见图2。

表2 两组血清IL-23和IgE水平比较

图2 IL-23与IgE相关性散点图

2.4不同程度AR患者CDCA5 mRNA相对表达水平及IL-23、IgE水平比较 重度组CDCA5 mRNA相对表达水平、IL-23及IgE水平高于中度组和轻度组，中度组CDCA5 mRNA相对表达水平、IL-23及IgE水平高于轻度组(P<0.05)。见表3。

表3 不同程度AR患者CDCA5 mRNA相对表达水平、IL-23及IgE水平比较

3 讨 论

AR是一种炎症疾病，它是由IgE介导的鼻黏膜病变。有研究发现，AR患者机体炎性反应水平升高[13]。AR临床症状以闭塞、连续性喷嚏和鼻痒为主，病情严重时会累及周围组织器官，对患者造成严重不良影响[14]。分子生物学研究发现，某些基因的不同等位基因与AR发展相关联，但由于AR发病受家族遗传及环境等诸多因素影响[15]，研究者还不能得出普遍性结论。因此，本研究探讨CDCA5、HLA-DPB1差异表达及IL-23血清水平差异与AR发病的相关性十分有意义。

CDCA5属于细胞分裂周期相关家族蛋白的一员。CDCA5是细胞分裂周期中染色单体分离与结合所必需的一种调节因子。CDCA5保证了细胞减数分裂与有丝分裂中染色体有序分离，在DNA修复中起重要作用。有研究发现，CDCA5与乳腺癌、胃癌等肿瘤发生及疾病预后相关[16-17]。有研究发现，CDCA5与哮喘有关，在哮喘患者中CDCA5表达水平明显升高[5],而AR与哮喘两类疾病在发病机制病理改变中有很大程度相似。在AR发病过程中存在广泛的淋巴细胞增殖和分化，但CDCA5在调节AR炎性反应中发挥的作用需进一步研究分析。笔者发现，与体检健康者比较，AR患者的外周血淋巴细胞中CDCA5 mRNA相对表达水平升高，说明CDCA5表达水平可能与AR发生相关。笔者进一步比较CDCA5 mRNA相对表达水平与AR发生的概率发现，CDCA5 mRNA高表达者患AR的比例明显高于CDCA5 mRNA低表达者。以上结果说明CDCA5可能与AR的发生密切相关，相关分子调控机制还需进一步研究。

近年来有研究者发现，HLA基因在免疫性疾病中发挥了重要作用，其与哮喘、过敏性皮炎都存在一定关系[6]。也有研究报道显示，HLA基因与鼻息肉发病的相关性，发现HLA基因是鼻息肉发病的易感基因与保护基因[18]，但目前关于HLA基因与AR的研究较少。有学者研究韩国人HLA-DPB1与哮喘可能相关，HLA-DPB1*0301是哮喘伴阿司匹林耐受不良的一项易感标志物[19]。本研究结果显示，病例组与对照组检测出8种等位基因，频率最高的等位基因为HLA-DPB1*0501，在病例组和对照组中的频率分别为34.6%和55.6%。孙筱放等[20]进行了HLA-DPB1基因DNA分型的检测，检测出12种等位基因，其中频率最高等位基因为HLA-DPB1*0501(基因频率37.4%)。最高频率基因型与本研究一致，本研究只检测出8种基因型，推测是由于此次选取的样本太小及其余等位基因在人群中占比较低。笔者比较病例组与对照组各等位基因频率，共发现有HLA-DPB1*0502与HLA-DPB1*040101，在组间差异明显，经过Logistic回归分析有HLA-DPB1*040101基因(OR=0.48，95%CI=0.300～1.555)、HLA-DPB1*0502基因(OR=0.57，95%CI=0.040～0.934)提升了患AR的风险。

部分研究者根据“IgE依赖性机制学说”，认为IgE与AR患病相关，IgE通过肥大细胞脱颗粒分泌出多种炎性介质，引发鼻黏膜炎症[7]。IL-23是IL-12细胞因子家族的成员，它除了具有与IL-12相同的p40亚基外，还具有一个IL-12没有的p19亚基[8]。IL-23主要产生于活化的巨噬细胞，其参与T淋巴细胞、抗原提呈细胞分泌免疫因子，对免疫相关功能起调节作用，与人体诸多自身免疫疾病有关联[9-10]。有研究表明，大鼠敲除IL-23基因后，机体免疫受损，机体内抗原提呈刺激T淋巴细胞分泌炎症因子的能力下降明显[21]。本研究结果表示，AR患者IL-23水平升高，且IL-23与IgE呈正相关，这表明IL-23可能是触发IgE介导Ⅰ型过敏反应产生的调节因子。提示IL-23与AR发病密切相关，具体机制有待后续研究。本研究结果显示，AR重度患者CDCA5 mRNA相对表达水平、IL-23、IgE水平高于AR轻、中度患者。猜测IL-23可能通过调节JAK/STAT3信号途径，抑制相关凋亡因子表达，引起嗜酸性粒细胞的聚集浸润，从而参与AR的发展。IL-23作用于嗜酸性粒细胞促进其凋亡，当IL-23水平降低时嗜酸性粒细胞凋亡延迟从而导致AR病情加重。这也表明了CDCA5、IL-23与AR疾病的发展有关，这可能成为判断AR疾病走向的预测性指标，若要运用于临床，后续还需补充大量试验证明。

综上所述，CDCA5、HLA-DPB1基因及血清IL-23水平可能在AR的发生与发展过程中发挥关键作用，相关分子调控机制还需进一步研究。CDCA5、HLA-DPB1、IL-23可能作为评价AR疾病进展的预测分子，并作为治疗和预防AR的潜在分子靶标。