ccfDNA中RERG甲基化状态检测在诊断鼻咽癌中的临床意义*

李宏丰，李 刚，云惟琳，张前飞，张秋叶

文昌市人民医院：1.耳鼻咽喉科；2.检验科，海南文昌 571300

鼻咽癌在我国南方和东南亚地区高度流行，年发病率为15/100 000～50/100 000[1]。然而，由于发病部位隐匿，多数患者早期无症状或仅表现出非特异性症状，80%以上的鼻咽癌患者在晚期(Ⅲ或Ⅳ期)才被首次确诊，这导致患者生存率大大降低[2-3]。因此，鼻咽癌的早期诊断是一个重大的临床挑战。异常的DNA甲基化已被报道为鼻咽癌等癌症的一种重要病变机制，甚至在癌变早期就能够检测到[4]。循环细胞游离DNA(ccfDNA)是存在于循环体液中游离状态的DNA，被认为与细胞的坏死、凋亡等相关[5]。近年来ccfDNA甲基化检测作为一种液体活组织检查技术已成为疾病诊疗中的研究热点[6]。在许多癌症类型中，RAS样雌激素调节生长因子(RERG)基因普遍以“全基因组”或“整体”DNA高甲基化的形式出现，进而导致RERG蛋白低表达。因此，RERG基因高甲基化是许多癌症常见的特征性甲基化变化之一[7-8]。在本研究中，笔者利用实时荧光定量PCR法DNA甲基化分析(qAMP)评估ccfDNA中RERG mRNA甲基化状态作为预期的鼻咽癌筛选生物标志物的潜力。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2020年1月至2021年6月本院100例经组织学确诊的原发性鼻咽癌患者作为鼻咽癌组，另选取97例年龄、性别相匹配的非癌志愿者作为对照组。本研究已获本院医学伦理审查委员会批准通过(批准号：2019-10-07)。所有参与者均签署书面知情同意书，并接受内窥镜检查。鼻咽癌组纳入标准：经病理活检和影像学检查确诊为鼻咽癌，为初诊患者且具有完整的病历资料。鼻咽癌组排除标准：(1)既往接受过放化疗或有其他恶性肿瘤病史，如非鼻咽癌头颈部恶性肿瘤或下腔静脉癌；(2)合并有严重心脑血管疾病、肝、肾、肺、胃肠等基础疾病。对照组纳入标准：年龄、性别与鼻咽癌组患者人群相匹配，经血液和超声等相关检查排除任何恶性肿瘤的临床证据。对照组排除标准：(1)存在恶性肿瘤的临床证据和高危因素(鼻咽癌病史、吸烟、饮酒、经常食用腌制或盐渍食品)；(2)存在有毒化学品等职业暴露；(3)合并有严重心脑血管疾病、肝、肾、肺、胃肠等基础疾病。鼻咽癌组中男67例，女33例；年龄19～78岁，平均(51.27±14.99)岁；根据AJCC/UICC第8版分期系统[9]，进行临床分期：TNM分期Ⅰ～Ⅱ期34例，Ⅲ～Ⅳ期66例；T1分期25例，T2分期34例，T3分期30例，T4分期11例；N0/1分期55例，N2/3分期45例；M0分期100例；Charlson合并症指数中位值1分(范围：0～3分)。对照组中男63例，女34例；年龄19～81岁，平均(50.79±15.19)岁；Charlson合并症指数中位值1分(范围：0～3分)，对照组EB病毒(EBV)检测均为阴性。两组年龄、性别构成、Charlson合并症指数比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1血液采集 采集患者入院时静脉外周血5 mL于乙二胺四乙酸(EDTA)管中。血液在4 ℃下3 500 r/min离心10 min，收集血浆，然后在4 ℃下20 000 r/min离心10 min，去除额外的细胞碎片和来自受损血细胞的基因组核酸污染。活检标本和血浆保存在-80 ℃，备用。另外收集鼻咽癌组患者EBV检测结果，包括衣壳抗原-早期抗原免疫球蛋白A(VCA-IgA)、早期抗原-早期抗原免疫球蛋白A(EA-IgA)、核心抗原(EBNA1-IgA)、EBV DNA拷贝数。

1.2.2活检组织DNA和ccfDNA提取 将活检标本用核糖核酸酶处理后，利用QIAamp DNA Mini试剂盒(德国Qiagen公司)提取总RNA游离基因组DNA。组织DNA用超净水洗脱。对于血浆样品，用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定414 nm处的光密度值(溶血临界值为0.13)。使用QIAamp MinElute ccfDNA Mini试剂盒(德国Qiagen公司)提取ccfDNA，每个受试者的血浆标本2 mL(1毫升/柱)用于DNA提取，每个色谱柱用30 μL超净水洗脱。从一份200 μg的组织标本中提取的组织DNA平均水平为50～240 ng，从一份血浆标本中提取的ccfDNA平均水平为3 ng。

1.2.3RERG基因甲基化率检测 通过qAMP法量化基因启动子甲基化率[10]。使用EpiTect Methyl Ⅱ DNA restriction Kit(德国Qiagen公司)，用甲基化敏感和/或甲基化依赖的限制性内切酶对分离的ccfDNA进行处理，包括非酶(Mo)、甲基化敏感酶(Ms)、甲基化依赖酶(Md)和甲基化敏感依赖酶(Msd)。反应消化液在37 ℃孵化过夜。培养后，在65 ℃加热灭活酶20 min后停止反应。采用 RT2 SYBR Green ROX qPCR Mastermix(德国Qiagen公司)和EpiTect Methyl Ⅱ PCR Primer Assay(德国Qiagen公司)分别对Mo、Ms、Md和Msd 4项指标进行甲基化定量PCR。数据分析模板用于计算甲基化率和数据质量控制。甲基化定量PCR的阈值周期值由制造商提供的数据分析电子表格计算，只有当单错校正和双错校验结果为“通过”(意味着限制性内切酶是活跃的，能有效地消化DNA)时，才使用目标基因的甲基化率进行统计分析。

1.2.4生物信息学分析 这项研究包括来自TCGA数据库(https：//portal.gdc.cancer.gov)的两组数据，RNA-Seq转录本数据和来自头颈部鳞状细胞癌(HNSC)标本的相应患者临床数据(HTSeq-FPKM类型)通过数据传输工具(GDC癌症数据共享系统)获得，共下载了528例HNSC患者HNSC组织和44例正常组织的RNA-Seq数据。将HTSeq-FPKM数据转换为TPM(每百万转录本读数)进行分析。根据HNSC患者RERG mRNA的中位表达值，分为低表达组和高表达组。这项研究使用R软件从GEO数据库中下载了GSE41613数据表中的RERG mRNA 表达数据和临床数据，作为生存分析的外部验证。通过Kaplan-Meier 分析评估RERG mRNA 的预后意义。此外RERG mRNA的拷贝数变异(CNV)和甲基化水平数据是通过 cBioPortal网络平台(https：//www.cbioportal.org/)获得的。利用SMART网络平台(http：//www.bioinfo-zs.com/smartapp/)分析和比较TCGA数据中RERG mRNA在HNSC组织和正常组织中的甲基化水平。使用MethSurv在线工具(https：//biit.cs.ut.ee/methsurv/)分析RERG mRNA甲基化水平的预后价值。β值表明DNA甲基化程度从0(未甲基化)到1(完全甲基化)不等。不同的β值最佳截断值已被认为表明超甲基化(β值：0.50～0.70)或低甲基化(β值：0.25～0.30)。

1.3统计学处理 采用SPSS21.0软件进行数据处理及统计分析，呈偏态分布的计量资料以M(P25，P75)表示，组间比较采用非参数检验。绘制受试者工作特征(ROC)曲线，并分析曲线下面积(AUC)、灵敏度及特异度以确认RERG mRNA甲基化率的诊断效能。采用Spearman相关分析ccfDNA和组织中RERG mRNA甲基化率的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1TCGA数据库资料分析 基于TCGA数据库的两组数据，HNSC组织中RERG mRNA表达明显低于正常组织，见图1A。RERG mRNA在HNSC组织中的表达情况与患者总生存预后无关(P>0.05)，见图1B。此外，HNSC组织中RERG mRNA甲基化β值高于正常组织(P<0.001)，见图1C、D。

注：A为RERG在HNSC组织和正常组织中的表达差异；B为Kaplan-Merei曲线分析RERG mRNA表达与HNSC患者生存预后的关系；C为RERG mRNA在HNSC组织和正常组织中甲基化差异；D为RERG mRNA在HNSC组织及其配对的癌旁组织中甲基化差异。图1 基于TCGA数据库分析RERG mRNA在HNSC组织中的表达和甲基化情况

2.2鼻咽癌组和对照组ccfDNA中RERG mRNA甲基化率比较 鼻咽癌组和对照组ccfDNA中RERG mRNA甲基化率分别为0.127(0.095，0.175)和0.023(0.014，0.036)，鼻咽癌组ccfDNA中RERG mRNA甲基化率高于对照组(Z=-11.881，P<0.001)，见图2。经ROC曲线分析，ccfDNA中RERG mRNA甲基化率诊断鼻咽癌的AUC为0.990(95%CI：0.980～0.999)，最佳截断值为0.059，此时灵敏度和特异度分别为93.0%和100.0%，见图3。

图2 两组ccfDNA中RERG mRNA甲基化率比较

图3 ccfDNA中RERG mRNA甲基化率诊断鼻咽癌的ROC曲线

2.3鼻咽癌患者ccfDNA和肿瘤组织中RERG mRNA甲基化率情况及相关性 鼻咽癌组ccfDNA中RERG mRNA甲基化率低于肿瘤组织[0.127(0.095，0.175)vs.0.278(0.184，0.364)，Z=-8.369，P<0.001]。Spearman相关分析结果显示，ccfDNA和肿瘤组织中RERG mRNA甲基化率呈正相关(r=0.407，P<0.001)，见图4。

注：A为肿瘤组织和ccfDNA中RERG mRNA甲基化率比较；B为Spearman相关分析散点图。图4 鼻咽癌组患者ccfDNA和组织中RERG mRNA甲基化率的关系

2.4ccfDNA中RERG mRNA甲基化状态与鼻咽癌患者临床特征的关系 鼻咽癌患者ccfDNA中RERG mRNA甲基化率在不同肿瘤T分期、N分期、TNM分期及EBV DNA状态人群之间差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 鼻咽癌患者ccfDNA中RERG mRNA甲基化率与临床病理特征的关系[M(P25,P75)]

续表1 鼻咽癌患者ccfDNA中RERG mRNA甲基化率与临床病理特征的关系[M(P25,P75)]

3 讨 论

鼻咽癌是一种发生于鼻咽组织的高度浸润性肿瘤，由于鼻咽癌早期相对无症状，很多患者在疾病晚期才被确诊。筛查识别早期鼻咽癌可能会改善患者治疗结果，因此寻求新的能够预测鼻咽癌的生物指标对于及时采取措施进行预防和治疗鼻咽癌具有重要的临床意义。

癌症诊断的“金标准”是组织活检，这种方法为侵入性，可能造成患者不适，且存在潜在并发症风险[11]。此外，肿瘤活检的可及性有限，不能反映肿瘤内部的异质性或肿瘤进化过程中新的亚克隆的出现。然而，液体活检是一种很有前途的方法，可以克服这些缺点。世界范围内人类癌症的发病率和死亡率较高，大部分与确诊较晚而导致治疗干预效果较差有关。而ccfDNA则为癌症患者的早期诊断提供了一种非侵入性的途径[12]。ccfDNA是由与细胞或细胞片段无关的双链核酸短片段组成。ccfDNA在血浆和血清中以0.1～20.0 kb的多核苷酸链存在。创伤、脑卒中及剧烈运动等刺激因素都可以引起ccfDNA水平明显增加[13]。健康人血液中ccfDNA水平范围为0～100 ng/mL。相比之下，癌症患者体内的ccfDNA水平平均高出4～40倍，上限超过1 000 ng/mL。肿瘤细胞普遍存在无限增殖能力，这也部分解释了患者较高的血浆ccfDNA水平[14]。RERG位于12p12染色体上，编码一个小的Ras超家族GTP结合和水解蛋白(GTPase)。RERG在多种正常组织中广泛表达，但在胰腺癌、乳腺癌、食管癌等肿瘤组织中则缺失表达[8,15-16]。此外，ZHAO等[17]结合甲基DNA结合域捕获技术和cDNA微阵列分析，发现了一种在鼻咽癌组织中表达下调的特异性高甲基化基因-RERG，并借助于体外细胞实验证实RERG在HK1、C666-1细胞株中的异位表达对细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力，以及外细胞信号调节激酶(ERK)/核因子κB(NF-κB)具有明显的抑制作用，说明RERG在鼻咽癌组织中常因为CpG岛甲基化而表达沉默，并通过抑制ERK/NF-κB信号通路发挥抑癌基因的活性。上述数据都支持RERG作为鼻咽癌治疗新的分子靶点。在本研究中，笔者利用TCGA数据库分析，证实RERG mRNA在HNSC组织中表达下调，且普遍存在基因高甲基化。然后进一步利用qAMP检测了临床标本中RERG mRNA甲基化率，证实鼻咽癌组ccfDNA中RERG mRNA甲基化率高于对照组，肿瘤组织和ccfDNA中RERG mRNA甲基化率呈正相关，且ccfDNA中RERG mRNA甲基化率与肿瘤进展及EBV感染有关。ZHAO等[17]研究曾证实，在EBV相关的NPC细胞系中，RERG经常被甲基化，导致RERG表达下调，进而通过ERK/NF-κB信号通路促进细胞增殖、集落形成和迁移。本研究结果显示，ccfDNA中RERG mRNA甲基化率略低于肿瘤组织，原因之一可能是ccfDNA不仅来自肿瘤细胞，部分也可能来自正常细胞。同时，标本类型之间的这种差异可能也包含生物学检测技术的偏差，例如限制性脱氧核糖核酸进入血液循环，或次优的血浆标本处理导致溶血。为了尽量控制误差，本研究中使用的非溶血性血浆可以防止血细胞中的核酸污染。此外经ROC曲线分析，ccfDNA中RERG mRNA甲基化率用于诊断鼻咽癌的AUC为0.990(95%CI：0.980～0.999)，说明其具有较好的诊断效能。

综上所述，ccfDNA中RERG mRNA甲基化鼻咽癌筛查中一个潜在的血液学生物标志物；虽然本研究标本数量有限，而且缺乏连续监测数据，但是最终的结果也为评估利用qAMP检测ccfDNA中基因甲基化率作为鼻咽癌特异性表观遗传标志物的大标本筛选方法提供了科学依据。