快速检测细菌性腹泻3种厌氧菌多重PCR方法的建立和应用

张凯川 ， 陈柳妃 ， 贾 坤

(华南农业大学兽医学院 广东省兽医临床重大疾病综合防控重点实验室 ， 广东 广州 510642)

厌氧菌是临床细菌性腹泻常见病原菌，通常与其他病原菌共同引起混合感染[1]。产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)和脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)是常见的容易引起厌氧菌感染的病原菌[2-4]。目前细菌混合感染的临床鉴别方法主要依靠鉴别性培养基以及染色镜检或者16S rDNA单一PCR扩增，存在准确率低、试验周期长等问题，而厌氧菌的分离鉴定需要特殊的厌氧气体环境和培养基，操作复杂、试验周期长、对技术人员要求较高。多重PCR(Multiplex polymerase chain reaction,MPCR)技术可以同时对多个样本进行检测，其试验周期短，准确率高，可快速鉴定细菌的类型[5]，为致病厌氧菌的检测提供了稳定、有效的方法[6-9]。本试验建立了一种同时检测产气荚膜梭菌、艰难梭菌和脆弱拟杆菌这3种厌氧菌的多重PCR方法，为临床上快速检测厌氧菌导致的细菌性腹泻提供有效、准确的技术手段。

1 材料与方法

1.1 菌株 产气荚膜梭菌ATCC13124标准株、艰难梭菌ATCC43593标准株和脆弱拟杆菌ATCC25285标准株，均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；大肠埃希菌ATCC25922标准株和金黄色葡萄球菌ATCC6538标准株，均由本实验室保存。

1.2 主要试剂 FTG液体培养基、强化梭菌培养基等，均购自广州环凯微生物科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒和粪便基因组DNA提取试剂盒，均购自北京天根生化科技有限公司；DL2 000 DNA Marker、100 bp DNA Ladder(Dye Plus)、PremixTaq(ExTaqversion 2.0 plus dye)等，均购自TaKaRa生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物合成 参照GenBank发表的产气荚膜梭菌Cpa基因序列、艰难梭菌Glud基因序列和脆弱拟杆菌Leu基因序列，设计合成了3对特异性引物(目的片段分别为326、448 bp和750 bp)，引物由广州天一辉远基因科技有限公司合成，引物序列、退火温度及目的片段大小见表1。

表1 引物信息

1.3.2 细菌DNA的提取 将菌株划线于强化梭菌培养基上，将平板置于厌氧环境中，37 ℃培养12 h，用无菌接种环挑取细菌单菌落置于盛有5 mL FTG培养基的试管中，37 ℃厌氧条件培养12 h，取2 mL扩增培养的菌液，使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取目的菌DNA。

1.3.3 单重PCR方法的建立及鉴定 以目的菌DNA作为PCR反应模板，PCR反应体系(25 μL):2×TaqMaster Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，引物各1 μL，模板2 μL。取10 μL扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，阳性产物送至广州天一辉远基因科技有限公司测序分析。

1.3.4 多重PCR反应条件的建立及优化 初步建立多重PCR反应体系：2×TaqMaster Mix 25 μL，引物各1 μL(终浓度为0.2 μmol/L)，产气荚膜梭菌、艰难梭菌及脆弱拟杆菌的DNA各2 μL为模板，加ddH2O补足至50 μL。反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃终延伸5 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳时间为45 min，电压90 V，电泳结束后采用凝胶成像系统分析。

1.3.4.1 多重PCR引物浓度的优化 对多重PCR反应引物浓度进行优化，各引物终浓度分别选取0.1、0.05 μmol/L和0.025 μmol/L进行，选取最佳浓度组合。

1.3.4.2 多重PCR退火温度的优化 对多重PCR反应退火温度进行优化，分别选取54.5、55.0、55.5、56.0、57.0、57.5、58.0、58.5、59.0、59.5、60.0 ℃共11个水平进行，PCR产物用 1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳结束后采用凝胶成像系统分析，选定最佳退火温度。

1.3.5 多重PCR检测的特异性试验 分别将3种菌株的模板与3种引物进行一至三重PCR所有配对可能性检测，同时以大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC6538为非特异性靶标菌，以此确定该PCR方法的特异性。

1.3.6 多重PCR检测的敏感性试验 采用平板计数法测得产气荚膜梭菌、艰难梭菌和脆弱拟杆菌菌液的初始浓度分别为3.7×1010、2.5×109CFU/mL和2.3×108CFU/mL。将菌液进行100～10-10梯度稀释，接着对稀释液进行DNA提取，以提取的DNA作为模板进行多重PCR敏感性与单重PCR敏感性比较，进而评价多重PCR的灵敏度。

1.3.7 多重PCR检测的重复性试验 用建立的多重PCR方法分别对产气荚膜梭菌、艰难梭菌、脆弱拟杆菌及这3种目的细菌的混合样本进行多次检测，以验证该多重PCR方法的稳定性。

1.3.8 多重PCR对临床样品的检测 对临床采集保存的8份疑似厌氧菌感染导致的腹泻样本进行增菌处理，使用粪便基因组DNA提取试剂盒提取核酸，进行多重PCR扩增检测。

2 结果

2.1 单重PCR扩增及产物鉴定 结果显示，各引物均能扩增出对应菌株的靶基因，凝胶电泳结果显示产气荚膜梭菌Cpa基因的大小为326 bp，脆弱拟杆菌Leu基因的大小为448 bp，艰难梭菌基因Glud的大小为750 bp，均与预期大小相符(图1)。

图1 单重PCR扩增结果

2.2 多重PCR反应体系与反应条件优化 通过对多重PCR退火温度和引物浓度的优化，最终获得多重PCR反应体系：2×TaqMaster Mix 25 μL，产气荚膜梭菌、脆弱拟杆菌、艰难梭菌引物各1 μL(终浓度分别为0.1、0.025 μmol/L和0.1 μmol/L)，模板各2 μL，加ddH2O补足至50 μL。最佳反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃终延伸5 min。

2.2.1 引物浓度优化 调整产气荚膜梭菌、脆弱拟杆菌、艰难梭菌的引物比例，优化多重PCR引物浓度。当产气荚膜梭菌、脆弱拟杆菌、艰难梭菌的引物终浓度分别为0.1、0.025 μmol/L和0.1 μmol/L时不产生非特异性条带，目的条带扩增效率高(图2)。

图2 多重PCR引物浓度优化

2.2.2 退火温度优化 以产气荚膜梭菌、脆弱拟杆菌、艰难梭菌的病原菌基因组 DNA等量混合作模板，将退火温度设定为54.5、55.0、55.5、56.0、57.0、57.5、58.0、58.5、59.0、59.5℃和60.0 ℃，以梯度温度作为退火温度进行多重PCR的退火温度试验。结果表明，多重PCR的退火温度为57.0 ℃时扩增效果最好(图3)。

图3 退火温度优化

2.3 多重PCR检测的特异性试验 利用建立的多重PCR方法对病原菌进行检测。以产气荚膜梭菌、脆弱拟杆菌、艰难梭菌的DNA作为模板，在50 μL体系中，3对特异性引物只扩增出对应的目的条带，产气荚膜梭菌在326 bp、脆弱拟杆菌在448 bp、艰难梭菌在750 bp处出现特异性条带，而其他非靶标病原菌未出现特异性条带(图4)。

图4 多重PCR的特异性

2.4 多重PCR检测的敏感性试验 利用PCR方法进行灵敏度检测，该PCR方法对产气荚膜梭菌、艰难梭菌和脆弱拟杆菌的最低检出量分别为1.6×10-2、0.7 pg/μL和2.8 pg/μL，产气荚膜梭菌和脆弱拟杆菌灵敏度略低于单重PCR，艰难梭菌灵敏度与单重PCR灵敏度一致(图5)。

图5 多重PCR的敏感性

2.5 多重PCR检测的重复性试验 该方法多次重复均能扩增出相同的目的条带，表明所建立的多重PCR方法具有较好的稳定性。

2.6 多重PCR对临床样品的检测 利用建立的多重PCR方法检测8份临床样本，所有样本均显示阳性，其中脆弱拟杆菌感染6份，产气荚膜梭菌感染7份；5份样品显示有混合感染的存在，同时，对PCR扩增的阳性样品进行测序，经NCBI序列比对相似性均高于99%，表明多重PCR检测方法能够对临床样品进行准确检测(图6)。

图6 临床样品的多重PCR检测

3 讨论

厌氧菌感染常见于手术创口感染和皮下软组织感染等，此类感染性疾病通常伴有多种病原菌存在的混合性感染[10-14]，由于多种细菌的存在，使得厌氧菌的分离与纯化变得愈加困难。传统的厌氧菌分离鉴定手段主要依靠细菌形态判断、镜检观察以及生化反应，厌氧菌的分离纯化需要在厌氧环境下进行，需要厌氧培养箱及无菌接种环，试验成本昂贵。

临床上厌氧菌感染多为混合感染，传统的厌氧菌鉴定方法难以满足现在的临床需求，多重PCR是一种能同时对多个靶标进行诊断的技术，多重PCR反应体系中存在多对引物和多个模板，相互之间发生作用的概率很大，很容易导致假阳性出现。因此，多重PCR的引物设计至关重要，应该选择各自相对保守的基因序列作为靶基因[15]。本试验参考GenBank中产气荚膜梭菌、脆弱拟杆菌、艰难梭菌相应靶基因的保守序列设计特异性引物。通过优化退火温度以及引物浓度，确保多重PCR的准确性，降低引物二聚体的形成。本试验中选取大肠埃希菌与金黄色葡萄球菌进行特异性检测，未能扩增出目的条带，证实该多重PCR具有较好的特异性。王恒[16]建立多重PCR检测方法用于检测粪便中胞内劳森菌、猪痢疾短螺旋体和艰难梭菌，其中艰难梭菌检测灵敏度为1.2 pg/μL。鲍长磊等[17]建立多重PCR检测方法用于检测产气荚膜梭菌，其中A型产气荚膜梭菌检测灵敏度为9 pg/μL。本试验建立的多重PCR检测方法检测灵敏度分别为产气荚膜梭菌1.6×10-2 pg/μL、艰难梭菌0.7 pg/μL、脆弱拟杆菌2.8 pg/μL。

本试验建立的多重PCR方法可以同时检测出产气荚膜梭菌、艰难梭菌和脆弱拟杆菌，具有试验方便、成本廉价等优点，有较为良好的稳定性，且此方法的准确率高。通过临床样品检测结果显示，多重PCR检测方法能准确鉴定临床腹泻样品中的厌氧菌，且试验操作简便、试验周期短，表明多重PCR检测方法具有临床样品检测的应用潜力[18]。本试验建立的多重 PCR方法为厌氧菌引起的细菌性腹泻的快速检测提供了重要的手段。