基于网络药理学探讨木棉花抗肝癌作用研究

韦立志 刘国萍 白法承 唐微艳 杨斌

肝癌是常见的消化系统恶性肿瘤之一，具有高发病率与高致死率的特点。据统计，我国每年因肝癌死亡患者数约占全球50%，排名全球首位［1］。广西是全国肝癌高发地区之一，近年肝癌发病率仍呈逐年上升的趋势，疾病防治形势严峻。中药具有安全性高、毒副作用小、患者接受度高等优点，对缓解肝癌患者症状，提高生活质量具有较好的帮助。

中药木棉花，系木棉科木棉属植物木棉的干燥花，广西、广东地区人民常用于治疗肠炎、泄泻、疮毒等疾病。现代药理学研究发现，木棉花富含黄酮、多糖、脂肪酸等多类活性成分，具有抗炎、抗肿瘤等药理学作用［2，3］。在本研究中我们通过网络药理学对木棉花和肝癌靶点进行汇集、通路富集分析，预测相关作用机制，并通过分子对接进行初步验证。

1 实验方法

1.1 木棉花有效成分筛选及靶点预测以“木棉花”为检索词，导入TCMSP 数据库，筛选标准为口服生物利用度≥40%，类药性≥0.2［4］，获得木棉花有效活性成分。

将筛选获得的木棉花有效活性成分分别导入药物靶点数据库Pharmmapper、Ctdbase、TargetNet，删除重复靶点，获得木棉花有效活性成分药物靶点。

1.2 肝癌疾病靶点预测以“Liver cancer”、“Hepatic carcinoma”、“Hepatocellular carcinoma”为检索词，导入疾病靶点数据库GeneCards、Disgenet Version，删除重复靶点，获得肝癌疾病靶点。

1.3木棉花防治肝癌潜在作用靶点预测将木棉花有效活性成分药物靶点与肝癌疾病靶点进行交汇比对获得共同作用靶点，绘制韦恩图。

1.4 木棉花防治肝癌蛋白质相互作用网络的构建将共同作用靶点导入STRING 数据库，选择“Multiple proteins”项，研究种属限定为“Homo sapiens”，以相互作用得分＞0.4 为限定条件［4］，构建蛋白相互作用网络（PPI 网络）。紧接着将PPI 网络数据导入Cytoscape 软件，并通过Cytohubba 插件筛选评分靠前核心蛋白。

1.5 木棉花防治肝癌核心蛋白的数据库验证通过The Human Protein Atlas、TIMER 数据库对核心蛋白在正常肝组织与肝癌组织中的蛋白与基因表达差异情况进行分析。

1.6 木棉花防治肝癌GO 富集和KEGG 通路分析将共同作用靶点导入DAVID 6.8 数据库中，进行GO 富集和KEGG 通路分析，以P≤0.05 为条件，进行数据分析。

1.7 分子对接验证选择木棉花有效活性成分通过分子对接验证其与预测排名靠前的信号通路核心靶点蛋白的亲和力大小。对接成功后，以结合能≤-5.0 kJ/mol 作为筛选依据，整理分析对接结果中的docking scores 分数并进行数据分析。

2 实验结果

2.1 活性成分筛选结果数据挖掘获得木棉花有效活性成分5 个，分别为菠菜甾醇、豆甾醇、槲皮素、4-乙烯基氯苄以及橙皮素，见表1。

表1 木棉花活性成分

2.2 木棉花活性成分对肝癌潜在作用靶点数据挖掘共获得木棉花活性成分作用靶点165 个，肝癌疾病靶点200 个。交汇比对后共得到33 个交集靶点。结果详见图1。

图1 木棉花活性成分对肝癌潜在作用靶点（韦恩图）

2.3 PPI 网络构建PPI 网络如图2 所示，网络节点数为33，边数为169，平均节点数10.2。Cytohubba 预测的前十核心靶点分别为：ESR1、TNF、EGFR、MDM2、RELA、PTPRC、JAK2、AR、MMP9 和MET。

图2 木棉花活性成分对肝癌潜在作用靶点PPI 图

2.4 GO 富集分析结果GO 富集分析结果包括生物过程（BP）、细胞组成（CC）和分子功能（MF）三项。如图3 所示木棉花对肝癌的治疗作用主要是通过参与了以下生物过程：调控细胞增殖、肽基络氨酸磷酸化过程、DNA 转录、调控RNA 聚合酶、信号转导等。细胞组成项方面，预测结果主要富集于：质膜、核浆、细胞核、细胞质基质、细胞质等。分子功能预测结果主要包括：蛋白结合、蛋白激酶活性、ATP 酶结合、蛋白激酶结合、锌离子结合等。

图3 木棉花活性成分对肝癌潜在作用靶点GO 富集分析结果

2.5 KEGG 通路分析结果DAVID6.8 数据库预测排名前10 信号通路见图4 所示，其中包括：癌症通路、Ras 信号通路、MAPK 信号通路、PI3K/Akt 信号通路、MicroRNAs 等。

图4 木棉花活性成分对肝癌潜在作用靶点KEGG 富集分析结果

2.6 基因及蛋白表达差异验证核心靶点在正常组织与肝癌组织中的基因表达差异情况，见图5。 结 果 发 现，ESR1、EGFR、MDM2、RELA、PTPRC、AR、MMP9 和MET 基因在正常肝脏组织与肝癌组织中表达具有显著差异。随后，通过HPA数据库对蛋白表达情况进行观察。与正常肝脏组织相比，肝癌组织中ESR1、TNF、EGFR、RELA、JAK2、AR 以及MMP9 蛋白的表达都明显增加，详见图6。

图5 正常肝脏组织与肝癌组织中的核心靶点的基因表达情况

图6 正常肝脏组织与肝癌组织中的核心靶点表达情况

2.7 分子对接结果通过分子对接对木棉花活性成分菠菜甾醇、豆甾醇、槲皮素、4-乙烯基氯苄和橙皮素与ESR1 蛋白进行结合能的预测分析。结果显示：结合能分别为-7.1 kcal/mol、-6.9 kcal/mol、-7.7 kcal/mol、-8.0 kcal/mol 和-6.7 kcal/mol，见图5。木棉花活性成分均与ESR1 蛋白具有较好的结合能力。

图5 木棉花活性成分与ESR1 蛋白分子对接结果

3 讨 论

本研究发现MMP-9 是中药木棉花抗肝癌的重要潜在作用靶点之一。基质金属蛋白酶是一类能够降解胶原、纤连蛋白等细胞外基质成分（ECM），也能够在免疫应答及炎症反应中发挥调控作用的蛋白。ECM 是阻碍肝癌细胞发生侵袭转移的重要屏障，而MMP-9 则可以将ECM 降解，破坏保护屏障，促进肝癌细胞转移与侵袭［5］。同时，MMP-9 蛋白还能够释放血管内皮因子参与肝癌组织内新血管的生成［6］。总之，MMP-9 与肝癌的进展关系密切。

女性肝癌发病率远低于男性，其可能与雌激素及雌激素信号通路的抗肿瘤作用有关［7］。雌激素作为内源性抗氧化剂能够抑制肝细胞凋亡，阻断肝纤维化-肝硬化-肝癌三部曲的发展［8］。雌激素与雌激素受体（ESR）结合后激活NF-κB、Bcl-2等下游靶蛋白调控细胞增殖、凋亡等生物学活动［9］。雌激素受体目前研究得较为透彻的是1 型（ESR1）与2 型（ESR2），在肝脏中雌激素主要是与ESR1 结合发挥活性。本研究通过数据挖掘发现ESR1 是木棉花活性成分与肝癌交互靶点中评分第一的关键蛋白；在正常肝组织与肝癌组织中ESR1 的基因与蛋白表达具有显著差异；分子对接验证发现，木棉花活性成分与ESR1 蛋白具有较好的结合活性。以上结果提示我们，中药木棉花的抗肝癌作用可能与抑制ESR1 及其相关信号通路有关。

简言之，本研究通过网络药理学筛选出中药木棉花活性成分菠菜甾醇、豆甾醇、槲皮素、4-乙烯基氯苄和橙皮素，发现活性成分主要通过ESR1、TNF、EGFR、MDM2、RELA、PTPRC、JAK2、AR、MMP9 和MET 等关键靶点，参与Ras、MAPK、PI3K/Akt 信 号 通 路 发 挥 抗 肝 癌作用。