葛根素通过抑制TLR4 信号通路改善LPS 诱导的认知障碍
2022-05-12黄佳林陈思琪杨钰华李绍健李艺
黄佳林 陈思琪 杨钰华 李绍健 李艺*
随着对疾病认知的加深和医疗技术的进步，脓毒症患者的死亡率已经显著下降，但在痊愈出院的患者当中，仍有高达六分之一的患者遗留长期的损伤，其中包括认知功能障碍［1］。脓毒症相关认知功能障碍的发病机制目前尚不明确，血管损伤和神经炎症可能是重要原因。其中，血管损伤被认为与脓毒症休克密切相关［2］。循环障碍导致的组织低灌注是脓毒症休克患者的症状之一［3］，而脑组织的慢性低灌注已被证实可导致动物的认知功能受损［4］。因此提高脓毒症患者的脑组织灌注可能有利于改善其遗留的认知障碍。
葛根素是从传统中药葛根中提取的有效成分，临床上可用于治疗缺血性卒中［5］。研究证实葛根的黄酮类提取物可舒张小鼠脑膜中的血管并增加血流灌注［6］，但其有效成分和机制尚未完全明确。因此本实验将在LPS 诱导的脓毒症小鼠模型中验证葛根素对认知功能和脑血流灌注的作用，并探讨其可能的机制，以期为脓毒症相关认知障碍的治疗提供新思路。
1 材料与方法
1.1 实验动物从中山大学实验动物中心购买30 只8 周龄雄性C57BL/6 小鼠，并饲养于SPF 级动物房。本研究的动物实验方案经过中山大学实验动物伦理委员会审核批准（SYSU-IACUC-2021-B1718），在实验过程中严格遵循动物伦理的相关规定对动物进行实验操作。
1.2 主要试剂LPS、DMSO 购自美国sigma 公司，葛根素购自北京索莱宝公司。TLR4、MYD88、TRAF6 抗 体 由santacruz 公 司 提 供，Iba1 抗 体 购 自Wako 公司，GAPDH 购自Proteintech 公司。
1.3 研究方法将30 只小鼠随机分为对照组（control 组）、造模组（LPS+Vehicle 组）、治疗组（LPS+Puerarin 组），每组10 只。造模组和治疗组腹腔单次注射LPS，注射剂量为5 mg/kg，对照组注射等体积生理盐水。治疗组在LPS 注射前两小时、注射后第二和第三天分别通过腹腔注射100 mg/kg 葛根素，对照组和造模组注射等体积10%DMSO。小鼠于LPS 注射后72 小时进行行为学测试和脑血流灌注成像。小鼠完成检测后进行取材，经左心室灌注生理盐水直至后分离大脑，一部分固定脱水并进行冰冻切片用于免疫荧光染色，另一部分提取蛋白质进行Western Blot 分析TLR4、MYD88、TRAF6 的表达变化。
1.4 Y 迷宫测试在安静舒适的环境中将小鼠轻柔地放入Y 形迷宫中，使用PhenoScan 软件对小鼠的运动进行记录分析，计算小鼠在各个臂中的交替次数并除以最大交替次数得到数据进行分析。
1.5 脑血流灌注成像使用气体麻醉机将小鼠充分麻醉后剪开头皮，将颅骨充分暴露，使用组织血流扫描成像分析系统（PERIMED PSI-ZR）对小鼠的脑血流进行1 分钟的成像，对1 分钟内摄取的图像中的血流数值取平均数进行分析。
1.6 统计学分析实验数据使用SPSS25.0 进行分析，定量资料以（±s）表示。采用LSD 法进行各组间的两两比较，P＜0.05 时认为有统计学差异。
2 结 果
2.1 葛根素改善LPS诱导的小鼠认知功能受损 见图1。
图1 葛根素改善LPS 诱导的小鼠认知功能受损
2.2 葛根素改善LPS诱导的小鼠脑组织血流灌注下降 见图2。
图2 葛根素改善LPS 诱导的小鼠脑组织血流灌注下降
图2 葛根素改善LPS 诱导的小鼠脑组织血流灌注下降
2.3 葛根素对脓毒症模型小鼠脑组织TLR4信号通路的影响 见图3。
图3 葛根素对脓毒症模型小鼠脑组织TLR4 信号通路的影响 注：对照组、造模组、治疗组小鼠脑组织TLR4、MYD88、TRAF6 的表达情况（图A、C、E）及与GAPDH 比值的统计（图B、D、F）。与对照组相比，*P＜0.05；与造模组相比，#P＜0.05。
2.4 葛根素对LPS诱导的小胶质细胞活化的影响 见图4。
图4 葛根素对LPS 诱导的小胶质细胞活化的影响
3 讨 论
LPS 诱导的脓毒症是研究脓毒症最常用的动物模型之一。Savi 等［7］对使用该模型的文献进行总结，发现不同剂量的LPS 均可导致动物急性期或慢性期的认知功能改变。脓毒症休克是脓毒症的表现之一，可表现为器官的血流灌注降低，严重时可导致死亡［3］。既往研究发现，在通过腹腔内注射粪便造成脓毒症模型的动物中可出现脑血流的显著降低，并可能与动物的认知功能下降有关［8］。因此，改善LPS 导致的脑组织灌注下降可能有助于减轻LPS 导致的认知障碍。
TLR4 是LPS 的直接作用靶点，而葛根素已被证实可抑制TLR4 及下游通路的激活［9］。因此，本研究通过研究葛根素对LPS 诱导小鼠认知功能下降的作用，发现葛根素可通过抑制LPS 激活的TLR4/MYD88/TRAF6 通路改善小胶质细胞的活化，提高小鼠脑组织的血流灌注进而改善小鼠的认知功能。本研究将为脓毒症及脓毒症休克患者认知功能受损的治疗提供新思路。
