尿激酶对脑组织影响的研究进展

赵岩+++吕涌涛

[摘要] 尿激酶型纤溶酶原激活物，简称尿激酶（uPA）是纤溶酶原的主要激活物之一。近年来的研究发现尿激酶在多种病理和生理过程中发挥了重要作用，包括创伤愈合、组织再生、细胞迁移，特别是癌症转移和血管生成等多种病理和生理过程。同时，尿激酶在神经系统疾病中广泛应用，包括溶栓和颅内血肿微创穿刺术中作为血肿液化剂使用。结合笔者工作，本文对尿激酶对脑组织的影响进行综述。

[关键词] 尿激酶；脑组织；神经损伤修复；脑损伤；研究进展

[中图分类号] R74 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）04（b）-0043-04

[Abstract] Urokinase type plasminogen activator （uPA） is one of the major activators of plasminogen. Recent studies have found that urokinase played an important role in physiological and pathological processes， including wound healing， tissue regeneration， cell migration， especially the physiological and pathological process of cancer metastasis and angiogenesis. At the same time， urokinase is widely used in the nervous system diseases， including the use of thrombolysis and intracranial hematoma minimally invasive surgery as a hematoma liquefaction agent. In this paper， the effects of urokinase on brain tissue were reviewed.

[Key words] uPA； Brain tissues； Repair of nerve injury； Brain injuries； Research progress

尿激酶型纤溶酶原激活物，简称尿激酶（urokinase，uPA）是纤溶系统的重要一员。uPA是一种特异性丝氨酸蛋白酶，可以被多种类型细胞合成，它可将不具有丝氨酸蛋白酶活性的纤溶酶原激活为具有丝氨酸蛋白酶活性、能溶解纤维蛋白的纤溶酶，对预防形成血栓和维持血流通畅很重要。目前uPA价格便宜，在国内广泛使用，且在颅内血肿微创穿刺清除术中作为血肿液化剂广泛使用，其能够将血肿快速溶解、引流，可明显降低颅内高压，减轻对周围脑组织的损害，减少脑疝的发生。uPA在国内临床应用广泛，然而关于uPA对脑组织影响的基础研究较少，故本文主要对uPA的结构、在神经系统中的作用、对脑組织的影响及临床应用进行综述。

1 uPA的结构研究

uPA是由中性粒细胞、单核细胞、成纤维细胞、上皮细胞、肿瘤细胞等多种类型的细胞合成和分泌的一种尿激酶原（pro-uPA），然后被纤溶酶、组织蛋白酶等激活成为一种丝氨酸蛋白水解酶，能催化纤溶酶原转化为纤溶酶，进而对纤维蛋白溶解、细胞外基质降解等一系列病理生理过程起到重要调节作用。uPA基因位于第10号染色体长臂（10q24-qter），大小为6.4 kb，细胞首先合成的单链酶原形式的uPA[1]，其相对分子量为50～55 kD，由2个二硫键桥连的多肽链连接成A链（轻链）和B链（重链）。A链的氨基末端包含与受体结合的氨端片段（ATF，氨基酸Ser），ATF本身包含N端表皮生长因子结构域（growth factor domian，GFD），其在氨基酸的12和32位之间负责与细胞表面特异性受体（uPA receptor，uPAR）结合。B链的羧基末端包含1个含有水解催化活性的丝氨酸蛋白酶片段（氨基酸Leu），其在氨基酸第179～184位之间为PAI-1的结合部位。uPA在第50～131位氨基酸残基之间含有3对链内二硫键，肽链折叠盘曲成一个环柄状结构为环柄状结构域（Kringle domain），也是uPA的一功能域。

2 uPA在神经系统中的作用

2.1 uPA与神经元再生

uPA在神经细胞再生、轴突生长及分支调节方面发挥重要作用。Semina等[2]研究通过使用野生型和uPA缺陷小鼠的3D外植体背根神经节（dorsal root ganglia，DRG）培养物，发现外源性uPA能显著刺激WT和KO-uPA小鼠的神经突向外生长。值得注意的是，与WT小鼠相比，来自KO-uPA小鼠的神经节中的uPAR表达升高，并且KO-uPA外植体中的自发神经突形成（神经突长度）高于WT小鼠DRG。与WT小鼠相比，uPA的使用导致KO-uPA小鼠的DRG神经突向外生长和神经细胞迁移的影响显著。这表明uPA有益于神经突的起始、伸长和分支。uPA通过与uPAR相互作用而对细胞迁移和神经轴突生长发挥作用，Semina等[2]使用Neuro 2A细胞培养物在体外使用uPA，观察到轴突生长速率增加也证实这一点。

2.2 uPA与神经损伤修复

陈沛等[3]曾试图在面神经断伤修复模型的基础上，使用外源性uPA，观察uPA对断伤后的面神经修复的影响。结果显示，加入uPA后，新生神经纤维髓鞘面积恢复的更大，纤维连接蛋白（fibronectin，FN）表达增强。其认为可能的原因是uPA能去除纤维蛋白间接抑制炎性反应来抑制损伤。与此同时，uPA通过对施万细胞移行、分化发挥正性调节，促使分化成为髓鞘[4]。2014年，张倩等[5]在建立大鼠慢性高眼压青光眼模型的基础上，腹腔注射uPA和等量生理盐水进行对照，结果显示，uPA组大鼠视网膜神经细胞数目明显高于对照组，而且在超微结构上，uPA组毛细血管壁的完整性明显高于对照组。这几位研究者分析uPA对视神经的这种保护作用可能是其通过改善视网膜的微循环，抑制视网膜神经节细胞的凋亡，增强视神经轴突的修复作用。

2.3 uPA与血脑屏障

MMP-9主要由中性粒细胞、血管内皮细胞、单核细胞、平滑肌细胞、星形胶质细胞、巨噬细胞和小胶质细胞等分泌。MMP-9主要降解Ⅳ和Ⅴ型胶原、弹性蛋白、明胶及层粘连蛋白等参与脑血管病的病理生理过程。

脑缺血灌注后，在炎性细胞因子、激素、生长因子刺激下，MMPs能够提高神经细胞的凋亡速度，水解基膜下细胞外基质成分蛋白同时增加血管通透性以及破坏血管完整性，并通过攻击血脑屏障，导致脑出血和脑水肿以致病情加重[6]。2005年，国外研究者发现uPA可增加动脉MMP-9的含量及活性[7]。2009年，李杰等[8]采用自体血栓塞大脑中动脉制备大鼠大脑中动脉闭塞模型，6 h静脉注射rt-PA与uPA，分别用免疫组化的方法檢测大鼠脑组织中MMP-9的表达水平。结果显示在uPA溶栓后，MMP-9的表达水平明显升高，进一步增加血脑屏障的通透性。2009年，宋玉强等[9]同样在大鼠脑梗死模型的基础上，经尾静脉给予uPA后免疫组化法检测脑组织的MMP-9表达水平，证实缺血后的级联反应产生的细胞因子可能诱导激活MMP-9，从而损伤血管内皮的完整性，使血脑屏障通透性增高。

2.4 uPA与脑水肿

AQP-4是一种选择性的水转运蛋白，在脑组织中表达最丰富，主要分布于星形胶质细胞膜表面，在神经细胞上选择性分布[10]。目前许多研究发现，AQP-4参加脑出血继发的脑水肿过程[11]，且脑水肿程度与AQP-4的表达呈正相关。宋倩颖等[12]通过兔脑出血模型，给予不同浓度的uPA进行干预，采用免疫组化测AQP-4在脑水肿组织中的表达水平，发现AQP-4阳性细胞呈现先逐渐减少后增加的趋势。可能是随着uPA浓度增加，血肿溶解增多，减轻对周围组织的压迫，兔脑血肿周围AQP-4阳性细胞的表达呈下降趋势，但高浓度的uPA溶解血肿时会释放血红蛋白等代谢物质，对血脑屏障通透性的破坏也随之增强，高浓度的uPA对脑组织是否存在神经毒性仍未可知。AQP-4在脑水肿过程的表达是动态的，不同时间阶段起的作用仍然有待进一步研究。综上所述，uPA干预后可以促进脑内血肿的引流，但最佳的治疗浓度仍然是讨论焦点。

3 uPA在脑部损伤中的基础研究

3.1 uPA与急性脑梗死

急性脑梗死是常见且危急程度极高的心脑血管疾病，严重影响到患者日后生存状态尤其是质量，因此对于脑梗死的临床治疗重视程度极高[13]。uPA是一种选择性溶栓剂，其通过激活体内的纤溶酶原变成纤溶酶，改善患者血流动力学。神经细胞的骨架结构微管相关蛋白2（microtubule associated protein 2，MAP-2）主要存在于神经细胞的细胞体和树突中，对神经元的发育、分化、神经元突起的生长以及线粒体的轴突转运发挥重要作用[14]。MAP-2减少，微管变形堆积、细胞骨架蛋白相互异常反应，导致轴突转运发生障碍以及神经元功能障碍，是导致神经元死亡的原因[15]。2005年，常丽英等[16]制作大脑中动脉闭塞模型，造模成功30 min后静脉注射uPA进行溶栓，观察uPA溶栓对MAP-2的影响。该研究病理学结果显示，溶栓后梗死区域明显缩小，神经元的损伤显著减轻。免疫组化结果表明，溶栓后MAP-2丢失的程度明显减小。其分析uPA溶栓改善神经功能的机制可能是：uPA溶栓治疗使得闭塞的血管再通，挽救缺血半暗带的脑组织，抑制缺血缺氧引起的钙离子内流、酸中毒等病理生理过程的进展，继而减少MAP-2降解改善神经功能。

3.2 uPA与脑复苏

脑组织几乎没有能量的储存，循环的血流连续不断的为大脑提供氧和葡萄糖保证脑组织的能量供应。全脑缺血后，很快出现氧和能量代谢衰竭，造成脑细胞和毛细血管壁受损，细胞内钙超载，氧自由基产生增加，激活膜上的磷脂酶A2，使膜磷脂分解，生成大量的花生四烯酸，再经环氧酶途径形成不稳定的中间产物PCG2和PGH2，前者经TXA2合成酶催化形成TXA2，后者则生成PGI2，TXA2大量合成，致PGI2/TXA2比例失调，凝血机制紊乱，加之血小板功能异常亢进，血小板聚集和黏附，使血液处于高凝状态，以致于形成血栓[17]。郭晓东等[18]经研究发现，大鼠心跳、呼吸骤停5、8 min复苏后，脑内血管有大量血栓形成，这不利于重建有效的脑血液循环。窒息5、8 min两组大鼠在开始复苏时给予uPA治疗后，两组大鼠脑神经细胞损伤程度均较未用药的对照组减轻，其中窒息5 min后用uPA组显示出脑细胞坏死程度明显低于未用uPA组。窒息8 min后用uPA复苏组的神经缺陷评分也显示明显低于未用uPA组，提示在心肺复苏早期应用uPA可以减轻因缺血造成的脑神经细胞损害，降低复苏后遗留的神经缺陷。

3.3 uPA与脑出血

在颅内血肿微创穿刺清除术中，最早应用的血肿液化剂是uPA。从国内大量的临床研究中可发现，颅内血肿微创穿刺清除术联合应用uPA可以有效清除脑内血肿[19-20]。基础实验方面，2016年，Tan等[21]将成年雄性SD大鼠自体血注入尾状核。大鼠颅内血肿内随机注射uPA、阿替普酶、生理盐水。通过血肿和脑水肿，脑组织含水量、伊万斯蓝色荧光和神经功能评分、MMPs、基质金属蛋白酶的mRNA，血脑屏障紧密连接蛋白及核因子B来评价在脑出血血肿溶解过程中这2种药物的作用。结果显示与阿替普酶比较，uPA能更好地改善脑水肿，改善脑出血预后，更有效地增加血脑屏障紧密连接蛋白的表达。有研究曾利用兔的脑出血模型，观察不同uPA浓度对脑出血血肿及血肿周围HO-1表达的影响，发现uPA浓度在5万U/mL时可明显增加兔脑血肿溶解的体积，兔脑出血血肿周围的脑含水量增加，HO-1的表达也增多，兔脑血肿周围脑含水量和HO-1阳性细胞数在3万U/mL组最低[22-23]。这两项研究都证明uPA浓度越高，血凝块溶解的效果越好；同时高浓度uPA会加重血肿周围脑组织的含水量和HO-1的表达。

神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）是一种与糖酵解过程有关的生物酶，共有αα、αβ、αγ、ββ、γγ五种同工酶，其中γγ存在于神经元细胞和神经内分泌细胞中[24]。在脑出血时，神经元细胞膜的完整性受到破坏，NSE不与细胞内肌动蛋白结合，从细胞内释放出来病迅速进入细胞间隙，通过血脑屏障进入外周循环，所以在脑出血后，血肿周围组织NSE蛋白表达明显增强[25-26]。国外研究者认为NSE具有保护、营养神经元的作用[27]。 2016年李兆星等[28]用Ⅳ型胶原酶诱导建立大鼠脑出血模型，模型建立10 h后，向血肿腔内注入5 μL含3000 UuPA的溶液来溶解血凝块，2 h进行立体定向颅内血肿微创穿刺清除术，用免疫组化法和Western blot分别检测NSE蛋白的表达情况。结果发现血肿内注射uPA并进行立体定向抽吸血肿后，大鼠血肿周围脑组织NSE蛋白表达情况降低。在脑出血早期进行颅内血肿微创穿刺清除术的同时使用uPA作位血肿液化剂，可较好地清除颅内血肿，降低脑组织NSE蛋白的表达，从而保护神经组织。

4 展望

通过对uPA不断的深入研究，近年来研究者发现uPA在神经系统神经再生、轴突生长、分支生长、神经损伤修复、脑复苏、脑水肿的发生和发展中都发挥一定的作用。大量的临床对照研究也证实颅内血肿微创穿刺清除术联合血肿液化治疗方案在脑出血治疗方面的有效性，但在颅内血肿微创穿刺清除术的临床应用中，选择uPA作为血肿液化剂也存在一些讨论热点：首先选择uPA作为血肿液化剂，uPA本身对脑组织会不会产生损害？其次在微创术中使用uPA，uPA剂量使用不规范，使用浓度从5000～50 000 U/mL不等，有没有一个合适的量效关系（uPA用量-脑出血量）指导uPA的用量？在颅内血肿微创穿刺清除术的临床应用中，uPA作为局部用药缺少在脑内代谢的相关研究。uPA在使用过程中存在的这些争议，需进一步研究，寻找更优良的使用方法和使用剂量。

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（收稿日期：2017-01-07 本文编辑：李岳泽）