耐碳青霉烯大肠埃希菌分子特征和同源性分析

黄家祥，王中新，潘亚萍，徐元宏

大肠埃希菌是引起医院和社区感染的主要病原体之一，通常作为人类和动物肠道正常菌群存在，但是在某些情况下，可引起人类肠道感染，还可侵入肠外组织引起尿路感染、腹腔感染、胆道感染、肺部感染、血流感染、脑部感染和肌肉结缔组织感染等[1]。近年来随着碳青霉烯类药物的广泛使用，耐碳青霉烯大肠埃希菌(carbapenem-resistantEscherichiaColi，CREC)已屡见不鲜。为了更好了解CREC耐药情况，预防耐药菌株院内传播，该研究收集安徽医科大学第一附属医院近5年的大肠埃希菌，从中筛选出碳青酶烯耐药的菌株，探讨CREC产碳青霉烯酶的表型、产酶基因的构成及其分子流行病学。

1 材料与方法

1.1 菌株来源收集安徽医科大学第一附属医院2015年1月-2019年12月临床标本分离并-20 ℃保存的6 092株大肠埃希菌，选取对厄他培南、亚胺培南或美罗培南耐药的菌株，转种血琼脂培养基复苏细菌，剔除重复分离株和死亡株，共71株CREC纳入本次研究。质控菌株：大肠埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705、肺炎克雷伯菌ATCC BAA1706。

1.2 仪器与试剂Vitek-2 Compact微生物鉴定仪、MALDI-TOF-MS质普仪、血琼脂培养基、MH琼脂培养基(法国Bio Merieux公司)，PCR扩增仪、凝胶成像系统、电泳仪(美国BIO-RAD公司)，高速离心机(德国Eppendorf公司)，生物安全柜(苏净安泰空气技术有限公司)，亚胺培南西司他丁钠[默沙东(中国)有限公司]，琼脂糖(德国Biofroxx公司)，硫酸锌、酚红(中国医药集团有限公司)，Taq PCR Mix 预混液(2×，含红染料)、引物、4S Red Plus核酸染料、TBE粉末、DNA分子量标准Marker(上海生工生物工程有限公司)。

1.3 细菌鉴定与药敏采用Vitek-2 Compact进行细菌鉴定，MALDI-TOF-MS质普仪进行确认。细菌药敏实验采用Vitek-2 Compact配套药敏卡AST-N334，纸片法进行复核和补充。

1.4 耐碳青酶烯酶表型实验

1.4.1改良Hodge实验 用无菌生理盐水制备0.5麦氏浓度的大肠埃希菌ATCC 25922菌悬液，将菌悬液用生理盐水按1 ∶10稀释后，无菌棉签蘸取稀释后的菌液，均匀涂布于MH琼脂平板上，自然干燥5～10 min，平板中央贴美罗培南(10 μg)纸片，用一次性无菌1 μl接种环挑取适量过夜培养的待测菌落，沿美罗培南纸片边缘，垂直方向画待测菌线，菌线长20～25 mm，空气环境中35 ℃培养18～24 h，结果判读：待测菌线与抑菌圈交界处大肠埃希菌ATCC 25922呈增强生长，判为阳性结果；无增强生长，则为阴性结果。

1.4.2mCIM实验 用10 μl接种环刮取1环血琼脂平板过夜培养的待测细菌加入含400 μl无菌水的EP管中，震荡混匀，浸入美罗培南纸片(10 μg)，35 ℃温育2 h。取出纸片，挤出多余菌液，贴于均匀涂布有0.5麦氏浓度大肠埃希菌ATCC 25922菌液的MH琼脂上，35 ℃温育18～24 h，测量抑菌圈直径。结果判读：① 抑菌圈直径为6～15 mm或直径为16～18 mm但抑菌圈内有散在菌落生长，提示待测菌株产碳青霉烯酶。② 抑菌圈直径≥19 mm，提示待测菌株不产碳青霉烯酶。③ 抑菌圈直径为16～18 mm或直径为≥19 mm但抑菌圈内有散在菌落生长，提示无法判断是否存在碳青霉烯酶。

1.4.3Carba NP实验 取a、b两个无菌EP管，均加入100 μl细菌蛋白提取液，用1 μl接种环取两环血平板上培养过夜的待测菌单菌落分别加入a、b管中，涡旋震荡5～10 s，再向a管中加入A液100 μl，向b管中加入B液100 μl，35 ℃孵育2 h，每0.5 h观察记录管中颜色变化。结果判读：① a、b管均为红色或橙红色，提示未检出碳青霉烯酶。② a管红色或橙红色，b管浅橙色、黄色或深黄色，提示检出碳青霉烯酶。③ a管红色或橙红色，b管橙色，提示试验结果无效。④ a管橙色、黄色或深黄色，b管任何颜色，提示试验结果无效。

1.5 PCR扩增耐药基因参照文献设计碳青霉烯酶基因引物，并由上海生工公司合成，引物序列见表1。采用煮沸法制备扩增模板。PCR反应体系总体积为50 μl：Taq PCR Master Mix(2×，red dye)25 μl，10 μmol/L正反引物各2 μl、DNA模板1 μl、ddH2O 20 μl。PCR反应条件：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s、根据各引物退火温度退火30 s、72 ℃延伸1 min、72 ℃最后延伸10 min、39个循环。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成像系统观察结果。阳性扩增产物委托上海生工公司进行测序，使用NCBI网站的Blast程序对基因序列进行比对，以确定基因型及其亚型。

表1 PCR引物序列

1.6 ERIC-PCRERIC-1引物序列为： 5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′，ERIC-2引物序列为：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′，由上海生工公司合成，反应条件如下：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s、50 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min、72 ℃最后延伸10 min、30个循环。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成像系统观察纪录结果。结果判断：将电泳图谱条带位置相同的菌株视为同一型别。

1.7 统计学处理药敏试验结果参照CLSI 2018标准进行判读，使用WHONET 5.4软件对细菌数据进行统计分析。

2 结果

2.1 菌株基本资料5年间CREC的检出率分别为1.00%(12/1198)、1.12%(14/1247)、1.01%(13/1287)、1.22%(15/1230)、1.50%(17/1130)，71株CREC主要来自尿液29株，其次为痰液15株，分泌物10株，血液5株；穿刺液、创面、腹水、引流液各2株；胆汁、脑脊液、脓液和咽拭子均为1株。病区来源以ICU和烧伤科为主，分别为8株和7株，其次为泌尿外科、门诊各5株；肝胆外科、感染科、急诊内科和康复科各4株；干部病房、神经外科、血液科和肿瘤科各3株；风湿科、呼吸科、神经内科、肾内科、胃肠外科、消化科和心脏外科各2株；产科、新生儿科、内分泌科和皮肤科各1株。

2.2 药物敏感性结果71株CREC对常见抗菌药物的耐药率普遍居高，见表2。

表2 71株CREC对常见抗菌药物的耐药率

2.3 表型试验结果71株CREC中45株MHT阳性， 67株mCIM阳性，69株Carba NP阳性，阳性率分别为63.38%、94.37%、97.18%。部分阳性结果见图1～3。

图1 部分菌株MHT试验结果阳性对照：1705即肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705；阴性对照：1706即肺炎克雷伯菌ATCC BAA1706；21：编号21的CREC(MHT阳性)

图2 部分菌株mCIM试验结果阳性对照：ATCC 1705即肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705；阴性对照：ATCC 1706即肺炎克雷伯菌ATCC BAA1706；9、12：编号9、12的大肠埃希菌(mCIM阳性)

图3 部分菌株Carba NP试验结果阳性对照：肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705；阴性对照：肺炎克雷伯菌ATCC BAA1706；1～5：Carba NP试验阳性菌株；47：Carba NP试验阴性菌株

2.4 耐药基因PCR扩增结果71株CREC共有43株检出碳青酶烯酶基因，检出率为60.56%，34株携带blaNDM中有7株为blaNDM-1，27株为blaNDM-5，9株携带blaKPC均为blaKPC-2。其余碳青酶烯酶基因blaBIC、blaIMP、blaSPM、blaAIM、blaGIM、blaDIM、blaSIM、blaGES、blaOXA-48均未检出。部分碳青酶烯酶基因电泳图谱见图4。

图4 部分blaNDM阳性电泳图谱M：DL2000 DNA Marker；1：阴性对照；2：阳性对照；3～11：blaNDM阳性菌株；12：blaNDM阴性菌株

2.5 ERIC-PCR结果71株CREC的ERIC-PCR电泳图谱产生2～8条不同的条带模式，范围从100～2 000 bp，共分为19个型别，其中A型9株，B型8株，C型7株，D型6株，E型6株，F型5株，G型5株，H型4株，I型4株，J型4株，K型3株，L型2株，M型2株，N型、O型、P型、Q型、R型、S型各1株。部分菌株ERIC-PCR电泳图谱见图5。

图5 部分菌株ERIC-PCR电泳图谱M：DNA Marker；2、3、6、8、11、14：B型；1、4、9、10、13、15：C型；18：A型；16：D型；19：E型；17：G型；7：K型；5：M型；12：P型

3 讨论

近年来，随着碳青霉烯类药物的广泛使用，耐碳青霉烯肠杆菌科细菌(carbapenem-resistantEnterobacteriaceae, CRE)在世界范围内越来越普遍。中国细菌耐药性监测网CHINET监测结果[6]显示大肠埃希菌对亚胺培南的耐药率由2014年的0.9%上升到2019年的2.0%。另外CRE感染往往会引起较高的死亡率，Tamma et al[7]研究发现32%的CRE血液感染患者在14 d内死亡，因此，防控CRE的产生和传播意义重大。

5年间，本院CREC的检出率基本维持在低位水平，平均为1.17%，且分离至不同年份不同科室，ICU和烧伤科来源的菌株数量略高于其他科室，可能与这两个科室的患者病情常较重，大量抗生素的使用和进行过侵袭性操作有关。本研究中，尿液标本分离的CREC高于其他样本类型，与Tian et al[8]研究结果一致，这对临床医师治疗泌尿道感染提出了严峻的挑战，由于氨基糖苷类、喹诺酮类和碳青霉烯类药物通常用于治疗泌尿系统感染，而CREC对这几类药物往往表现出较高的耐药性。

到目前为止，CLSI先后推荐了MHT、Carba NP和mCIM作为碳青霉烯酶的表型筛选实验。MHT操作简单且成本低廉，对流行广泛的KPC具有很好的检测能力，但对新德里金属-β-内酰胺酶(NDM)、粘质沙雷菌型碳青霉烯酶(SME)和苯唑西林酶(OXA)的敏感性较低[9]。Carba NP通过测量细菌提取物对亚胺培南的体外水解情况来检测碳青霉烯酶，Carba NP对大多数碳青霉烯酶具有较好的敏感性，然而，在检测相对较弱的OXA型碳青霉烯酶时存在一定的局限[10]。mCIM是2017年CLSI推荐的一种用于筛选碳青霉烯酶表型的新型试验，有研究[11]表明mCIM筛选肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶具有较高的特异性和敏感性。本研究中，34株产NDM的菌株只有22株MHT阳性，说明MHT对NDM型碳青霉烯酶的检测能力有限。71株CREC，mCIM阳性67株，阳性率94.4%，略低于闫玲 等[12]报道的阳性率100%。Carba NP阳性69株，仅有2株阴性，虽然Carba NP具有很好的检测效能，但是所需试剂准备繁琐、保质期较短，大规模流行病学筛查远比实验室小样本检测更能体现其优势。

产NDM细菌发现之初被称为“超级细菌”，可见其耐药情况严重，NDM能够水解几乎所有的β-内酰胺类抗生素，大肠埃细菌和肺炎克雷伯菌是blaNDM的主要携带者。目前世界范围内均发现NDM阳性菌株，尤以印度次大陆、中东和巴尔干地区的流行率最高[13]。一项关于CRE在国内流行情况的研究[14]显示，25个省、直辖市中，除北京、上海和四川外，NDM是CREC最常见的碳青霉烯酶。本研究中，43株CREC检出耐碳青霉烯基因，34株(34/43，79%)携带blaNDM，9株(9/34，21%)携带blaKPC-2，提示blaNDM是本院CREC主要携带的碳青霉烯酶基因，与全国绝大多数地区相一致。

ERIC-PCR是一种可靠、快速的基因分型方法，目前已广泛应用于细菌的流行病学研究。本研究使用该技术对71株CREC之间的遗传相关性进行研究，CREC被分为A-S共19个型别，没有发现优势型别，相同型别菌株所属科室较为分散，且分离年份未见集中现象。说明本院流行的CREC基因多态性较高，以散发为主。