胚胎期炎症影响衰老海马SNAP-25含量及认知功能

韦琪瑶，吴永芳，张雨欣，王亚涛，曾立平，陈贵海，曹 磊

胚胎期炎症暴露会加速小鼠年龄相关的记忆减退[1]，但其确切机制仍不清楚。研究[2]表明年龄相关的记忆减退可能与突触可塑性相关蛋白含量的改变有关。突触体相关蛋白25(synaptosomal-associated protein 25, SNAP-25)是可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(SNARE)的囊泡蛋白，参与突触可塑性和神经递质的胞吐过程[3]。研究[4]表明，SNAP-25在成年大鼠海马中过表达会导致记忆巩固的解除以及突触传递障碍，即SNAP-25可以通过改变突触可塑性来影响认知能力。细菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰阴性菌细胞壁的成分，会使机体发生神经炎症，可用于制作经典的炎症模型[5]。本课题组前期研究[6]显示胚胎期暴露LPS会加速年龄相关的记忆减退的发生。然而，海马SNAP-25蛋白水平改变是否参与胚胎期炎症暴露导致的认知功能损害仍未见相关报道。故该研究拟探讨胚胎期炎症暴露是否会引起中老年小鼠海马SNAP-25蛋白水平改变，及其是否与学习记忆损害相关。

1 材料与方法

1.1 实验动物及模型建立清洁级2月龄CD-1小鼠购自湖南省斯莱克景达实验动物公司。雌鼠24～26 g，雄鼠27～29 g。小鼠饲养于温度(23 ± 2) ℃，湿度(50 ± 5)%，明暗周期12 h交替进行的环境中，自由获取食物和水。小鼠按2∶1(雌∶雄)于21：00合笼，次日07：00查阴栓，首次查到阴栓者定为受孕第0天(G0)。孕鼠单笼饲养并随机在孕第15～17天每天腹腔注射LPS(50 μg/kg)，或等容积生理盐水，对应子鼠分别为LPS组和CON组。每组选取3月龄(6只雄鼠)和15月龄(6只雄鼠)纳入实验。本实验所有操作均符合安徽医科大学动物实验伦理委员会的要求。

1.2 Morris水迷宫(MWM)采用MWM任务评估小鼠空间学习和记忆能力。实验装置为黑色圆形水池(直径150 cm，高30 cm)及黑色圆柱状逃生平台(直径10 cm，高24 cm)，池内水温保持(22 ± 2) ℃。水迷宫上方安装摄像头采集小鼠运动轨迹，运用Any-maze软件分析图像。水迷宫周围用白色帘布(距水池边缘50 cm)包围，并在距水池底1.5 m高处等距离悬挂3个黑色线索。整个实验过程中，平台位于靶象限内，并低于水面1 cm。实验过程分为：① 学习期(定位航行期)：首次测试前，将小鼠放到平台 30 s，再将小鼠分别从不同象限面向池壁放入水中，每次给予60 s时间来寻找水下平台。每次测试间隔15 min，每天完成4次测试，连续7 d。记录平均游泳路程，作为小鼠学习能力的指标。② 记忆期(空间探索期)：小鼠完成第7天学习期实验后，休息1 h，在移除平台的情况下，从与靶象限相对的象限再次入水。小鼠被允许在水池中自由游泳60 s。记录靶象限游泳路程占总路程的百分比，作为空间记忆能力的指标。

1.3 试剂与仪器RIPA细胞裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司；ECL超敏发光试剂盒购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；鼠抗SNAP-25(sc-20038)购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；羊抗鼠二抗(ZB-2305)、鼠抗β-actin(TA-09)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。徕卡切片机(德国Leica公司)；数字扫描仪(Motic公司)。

1.4 标本制备行为学实验结束两周后，小鼠颈椎脱臼处死，冰上取脑，并快速分离出海马。将左脑于4 %的多聚甲醛溶液中固定，脱水、浸蜡、包埋。蜡块经 -20 ℃冷冻后，3 μm厚连续冠状切片进行免疫组化分析。

1.5 免疫组织化学染色及摄片采用链霉亲和素-生物素复合素法(SABC)进行检测。一抗为鼠源性抗SNAP-25蛋白抗体，二抗用生物素标记的山羊抗小鼠IgG，最后用DAB显色。用数字扫描仪拍摄海马整体，然后用4×20倍显微镜分别对海马CA1、CA3、DG区进行拍摄。应用Image Pro Plus 6.0图像分析软件进行图像分析。采用平均光密度值(average optical density, AOD)作为SNAP-25蛋白相对含量进行统计分析。

1.6 Western blot分析收集组织样本，加入蛋白质中性裂解缓冲液(RIPA)后提取上清液，在提取的蛋白组织中按照1 ∶4加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，沸水浴加热10 min，充分变性蛋白。样品冷却至室温后，把样品上样到SDS-PAGE胶加样孔内，电泳仪先用80 V、30 min，然后改为120 V、1 h。恒流转膜30 min，漂洗5 min，加入5 % 脱脂奶粉后于室温封闭2 h。然后加入一抗(anti-SNAP-25，鼠抗，1 ∶1 000稀释)，4 ℃缓慢摇动孵育过夜，使用PBST洗涤。再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1 ∶20 000)，室温孵育1 h，PBST洗涤后，用ECL发光试剂盒来检测蛋白。使用Image软件分析蛋白条带，计算SNAP-25的相对表达量。

1.7 统计学处理使用SPSS 23.0统计软件进行分析，数据符合正态分布，用均数±标准误表示。Morris水迷宫学习期成绩采用重复测量方差分析，记忆期成绩和SNAP-25含量采用两因素方差分析，观察处理因素和年龄因素的影响。组间两两比较采用LSD检验。采用Pearson相关分析法分析SNAP-25含量与行为学数据之间的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Morris水迷宫实验

2.1.1学习期 小鼠的游泳路程随天数增加而减少[F(6，120)=132.034，P<0.01],且四组间游泳路程差异有统计学意义[F(3，20)=45.707，P<0.01]。两两比较分析表明，15月龄CON组游泳路程长于3月龄CON组[F(1，10)=19.811，P=0.001]，见图1A；15月龄LPS组游泳路程较同龄CON组延长[F(1，10)=34.690，P<0.01]，见图1C；而3月龄LPS组与3月龄CON组间游泳路程差异无统计学意义 [F(1，10)=3.163，P=0.106]，见图1B。

2.1.2记忆期 四组间小鼠靶象限游泳路程百分比差异有统计学意义[F(3，20)=21.243，P<0.01]。组间比较显示，与3月龄CON组比较，15月龄CON组的靶象限游泳路程百分比下降[F(1，10)=15.421，P=0.003]，见图1D；与15月龄CON组比较，15月龄LPS组的靶象限游泳路程百分比下降[F(1，10)=5.909，P=0.035]；而3月龄LPS组与CON组间差异无统计学意义[F(1，10)=2.858，P=0.122]。

图1 各组小鼠学习期游泳路程和记忆期靶象限游泳路程百分比比较A、B、C：各组学习期游泳路程；D：记忆期靶象限游泳路程百分比；与3月龄CON组比较：**P<0.01；与15月龄CON组比较：#P<0.05，##P<0.01

2.2 海马SNAP-25蛋白水平免疫组织化学和Western blot结果显示SNAP-25蛋白在海马DG、CA1、CA3区均表达(图2)，且四组间海马SNAP-25总体水平差异有统计学意义[F(3，20)=170.100，P<0.01] ，见图3。两两比较显示，15月龄CON组比3月龄CON组的海马SNAP-25总体水平升高[F(1，10)=12.861，P=0.005]，见图3B，且在海马CA1、DG、CA3区均增加[F(1,10)=82.916、53.368、14.110，P<0.01]，见图3C；3月龄LPS组较同龄CON组海马SNAP-25总含量增加[F(1，10)=120.532，P<0.01]，区域差异表现为DG区和CA1区升高[F(1,10)=62.846、389.145，P<0.01]，而CA3区降低[F(1,10)=146.263，P<0.01]；15月龄LPS组海马SNAP-25蛋白水平也高于同龄CON组[F(1，10)=613.344，P<0.01]，具体也是海马DG和CA1区增加[F(1,10)=174.102、411.898，P<0.01]，而在CA3区呈临界意义下降[F(1,10)=4.959，P=0.050]。

图2 各组小鼠SNAP-25蛋白在海马各亚区中的表达 A:3月龄CON组；B：3月龄LPS组；C：15月龄CON组；D：15月龄LPS组；1：海马区 ×4；2：DG区 ×20；3：CA1区 ×20；4：CA3区 ×20

图3 各组小鼠海马SNAP-25蛋白水平比较A：各组免疫印迹条带图； B：各组SNAP-25蛋白总体水平的比较；C：各组海马亚区的SNAP-25蛋白水平的比较；a：3月龄CON组；b：3月龄LPS组；c：15月龄CON组；d：15月龄LPS组；与3月龄CON组比较：**P<0.01；与15月龄CON组比较：##P<0.01

2.3 海马SNAP-25水平与空间学习记忆能力的相关性Pearson相关分析结果显示，15月龄LPS组和CON组小鼠海马SNAP-25总体水平与学习期游泳路程呈正相关(r=0.949，P=0.004；r=0.917，P=0.010)，与记忆期靶象限游泳路程百分比呈负相关(r=- 0.901，P=0.014;r=- 0. 929，P=0.007)；具体到海马亚区则是CON组和LPS组的海马CA1(r=0.867，P=0.025；r=0.877，P=0.022)和DG(r=0.817，P=0.047；r=0. 947，P=0.004)区SNAP-25水平与学习期游泳路程呈正相关，与记忆期靶象限游泳路程百分比呈负相关(CA1：r=- 0.817，P=0.047；r=- 0.894，P=0.016；DG:r=- 0. 939，P=0.005；r=- 0. 843，P=0.035)。3月龄各组海马总体和各亚区及15月龄各组CA3区SNAP-25水平与学习期游泳路程和记忆期靶象限游泳路程百分比均无相关性(P>0.05)，见表1。

表1 海马各亚区SNAP-25相对含量与Morris水迷宫成绩的相关性[r 值(P值)]

3 讨论

目前年龄相关的记忆减退对老龄人口的健康威胁日益加剧，为了提高老年人的生活质量，需要对衰老相关认知障碍机制进行深入研究。海马结构和功能的完整性在维持正常的学习和记忆巩固中发挥了重要作用[7]。众所周知，母亲孕期感染炎症是子代生命早期最常见的不良因素。以往研究[6]表明，母鼠孕晚期暴露于LPS会加剧子代海马依赖的年龄相关的记忆减退。本研究进一步支持了小鼠空间学习记忆能力呈年龄相关性损害的结论，即中老年小鼠的空间性学习记忆能力减退(表现为中老年小鼠在MWM中的表现较青年组差)，而母体孕晚期炎症可恶化子代的这种效应(表现为中老年LPS组行为学表现较同龄对照组差)。

本课题组前期证实母鼠孕期经腹腔注射低剂量LPS(50 μg/kg)不会造成不良妊娠结局，且子鼠可经历正常的生长发育，但在衰老过程中会提前出现空间学习记忆能力减退[8]。其机制可能是母体中的促炎因子通过胎盘屏障，直接影响胎儿大脑或损害胎盘功能，进而导致后代行为和中枢神经系统结构(包括突触可塑性)及功能产生持久的或程序化变化[9]。突触可塑性是学习和记忆形成的基本机制，而突触相关蛋白水平的变化会导致突触结构发生微观改变和神经递质传递障碍。SNAP-25作为突触相关蛋白，对神经递质释放及突触可塑性的调节起重要作用[10]。然而，胚胎期炎症暴露是否会导致中老年海马SNAP-25蛋白水平的改变尚未可知。研究显示SNAP-25在衰老的啮齿类海马的表达水平并不一致，比如在Fischer雌性老年(30月龄)大鼠中发现海马SNAP-25蛋白质水平升高[11]，而在老年(18～24月龄)Wistar雄性大鼠中海马SNAP-25蛋白水平降低[12]。本课题组前期研究显示，老年(22月龄)昆明小鼠海马和额叶的SNAP-25蛋白含量是增加的[13]。本研究结果与之一致，即中老年CD-1小鼠海马总体及各区的SNAP-25蛋白水平较青年期升高。

本研究首次观察了胚胎期炎症暴露对中老年海马SNAP-25蛋白的影响，发现与中老年对照组相比，同龄LPS组的海马总SNAP-25蛋白含量升高，贡献主要来自DG和CA1区。这表明胚胎期炎症暴露会上调中老年海马DG和CA1区SNAP-25蛋白的表达。青年LPS组小鼠的海马DG和CA1区SNAP-25蛋白水平也高于青年对照组。提示胚胎期炎症暴露的小鼠可能在青年期就已经出现学习记忆功能损害的神经生物学基础，尽管行为学表型尚未发生改变。值得注意的是，两个年龄的LPS组海马CA3区SNAP-25蛋白表达有下降。这也许表明胚胎期炎症暴露的小鼠SNAP-25基因的表达可能存在海马区域特异性。

研究[1,14]表明，海马的一些突触可塑性相关蛋白(如Syt1、PSD-95和GluA1)的改变均与年龄相关的认知损害有关。突触相关蛋白SNAP-25参与调控突触前和突触后机制[15]，可能是研究年龄相关的记忆减退的良好指标。McKee et al[4]的研究发现过表达海马SNAP-25会导致成年大鼠认知功能的损害。本课题组前期研究[13]也提示昆明小鼠和ICR小鼠年龄相关性记忆损害与海马SNAP-25含量升高有关。然而，海马SNAP-25蛋白的改变是否参与胚胎期炎症暴露导致的认知损害仍不清楚。本研究表明，中老年对照组和LPS组小鼠海马CA1区及DG区SNAP-25蛋白水平均与空间学习损害呈正相关，而与记忆损害呈负相关。这些发现进一步提示了海马CA1和DG区SNAP-25蛋白可能参与衰老或胚胎期炎症暴露导致的年龄相关记忆损害的机制。然而，所有年龄组的小鼠海马CA3区SNAP-25蛋白水平与空间学习记忆损害无相关性，说明CA3区SNAP-25的降低未参与胚胎期炎症暴露加速年龄相关性记忆损害效应。

综上所述，中老年海马DG和CA1区的SNAP-25蛋白上调可能参与了胚胎期炎症暴露加速的年龄相关性认知功能损害。但是，未检测胚胎期炎症暴露导致的认知损害与SNAP-25蛋白之间关联的具体机制为本研究的主要缺陷。