OSA诱导的鼠模型中长非编码RNA的表达谱：发病机制的新见解

明 亮，杨慎友，黄 埔

(1 邹平市人民医院，山东 邹平 256200；2 金乡县人民医院，山东 金乡 272200；3山东国欣颐养集团枣庄医院，山东 枣庄 277100)

阻塞性睡眠呼吸暂停(Obstructive sleep apnea，OSA)是以睡眠时上气道反复塌陷为特点，并伴随血氧下降和睡眠结构紊乱的睡眠呼吸障碍性疾病，是心血管疾病独立的危险因素，患者通常伴有全身或肺动脉高压、糖尿病或肥胖。其发病机制包括交感神经激活、内皮功能障碍、氧化应激和炎症[1-2]。而OSA诱发心血管疾病的具体病理生理学和确切的潜在机制还有待阐明。

最近的研究表明，长链非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNAs)以表观遗传调控、转录调控和转录后调控的形式调控基因表达，并在X染色体沉默、基因组印记和染色质修饰中发挥作用[3]。lncRNAs与癌症的密切关系正逐步得到证实，但其在OSA诱发心血管疾病的过程中是否发挥作用有待研究。本研究对慢性间歇性缺氧(Chronic intermittent hypoxia，CIH)鼠模型的心脏组织通过Illumina测序平台进行了lncRNAs和mRNAs表达谱分析，为进一步研究lncRNAs在OSA诱导的心血管疾病中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1研究对象 雄性8周龄C57BL/6J小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司，共20只，平均体重(20.18±0.70)g，普通饲料常氧条件下饲养1周后将其随机分为CIH组和对照组，各10只。

1.2方法 CIH组小鼠模型的制备见参考文献[4]。小鼠心脏组织RNA的提取：两组小鼠分别培养3个月后各取3只处死，将其新鲜心脏组织用trizol试剂提取总RNA以便测序。RNA的测序及分析：两组小鼠心脏组织的lncRNAs和mRNAs表达谱的检测由北京安诺优达基因科技有限公司采用Illumina测序平台完成，数据分析由北京中康博生物科技有限公司辅助完成。

1.3数据处理 用R(3.5.1)以及R studio软件及可视化R包-ggplot2(3.1.0)对不同样本、实验条件中差异表达的RNA进行层次聚类分析，包括聚类热图、散点图和火山图。采用GO/KEGG进行富集分析。lncRNAs及mRNAs筛选的标准为差异倍数变化值≥1.2且P≤0.05。

2 结果

2.1两组lncRNAs和mRNAs表达量的分析 分层聚类分析结果见封三图1A、B；浓度分布趋势散点图见封三图1C、D；两组lncRNAs及mRNA基因表达差异结果的数据分布见封三图1E、F。比较发现66条lncRNAs和1606条mRNAs在CIH小鼠心脏组织中表达有差异。66条lncRNAs中上调的有13条，下调的有53条；1606条mRNAs中，上调的有476条，下调的有1130条。见封三图2。

2.2CIH小鼠mRNAs的生物信息学分析 GO分析：增强的功能有100个，重要的增强功能是活性氧代谢过程、NF-κB的细胞质隔离、白细胞介素-1β分泌、巨噬细胞细胞因子产生的正调控、细胞死亡的负调控；减弱的功能有225个，包括免疫系统过程、细胞增殖的负调控、Wnt信号通路、平面细胞极性通路的正调控、细胞生长的负调控、平滑肌细胞迁移的负调控、凋亡过程、内皮细胞迁移的正调控、信号转导的负调控等。

KEGG分析：有37条上调通路和88条下调通路。上调的通路有意义的有：氧化磷酸化、HIF-1信号通路、癌症的中枢碳代谢、PPAR信号通路、p53信号通路；下调的通路有意义的有：癌症的通路、趋化因子信号通路、MAPK信号通路、Jak-STAT信号通路、IL-17信号通路、血管内皮生长因子信号通路、甲状腺癌、癌症中的转录失调等。分类分析中，高级分类主要与生物系统、人类疾病、新陈代谢、环境信息处理、细胞过程相关，中级分类也体现出与信号转导、癌症、内分泌系统、免疫系统、心血管疾病等相关。

2.3生物学标志物的共表达数量及差异表达情况 两组差异表达的基因与另一基因的共表达情况如表1所示，取共表达最多的前10个差异表达基因，其中Gm13056及AC157516.1的表达上调，余基因表达均为下调。

表1 两组生物学标志物的共表达数量及差异表达情况

3 讨论

对于OSA，理想的生物标志物不仅与疾病严重程度相关，而且对心血管结局有很强的预测作用，其水平的改变将相应地降低风险。RNA测序用于发现疾病患者与健康人之间差异表达的基因，针对miRNAs的测序分析相对比较成熟，然而对lncRNAs的研究较少。lncRNAs是长度大于200个核苷酸的非编码RNA，起初被认为是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物，不具有生物学功能。后来的研究发现，lncRNAs不仅参与X染色体沉默、基因组印记、染色质修饰、转录激活等调控过程，而且其转录过程还会影响染色质的三维结构，作为转录和转录后调节因子以及染色质修饰复合物的向导发挥着重要作用[5-6]。为了揭示lncRNAs在调节OSA功能过程中的重要作用，一些研究学者描述了lncRNAs在慢性间歇性缺氧中的表达[6]。

本文对lncRNA在CIH小鼠中的表达及可能的作用机制进行了研究，发现13条lncRNAs和476条mRNAs表达上调，53条lncRNAs和1130条 mRNAs表达下调。对有差异性表达的上下调的mRNAs进行了GO分析发现：功能增强的有100个，重要的增强功能是活性氧代谢过程、NF-κB的细胞质隔离、白细胞介素-1β分泌、巨噬细胞细胞因子产生的正调控、细胞死亡的负调控；减弱的功能有225个，包括免疫系统过程、细胞增殖的负调控、Wnt信号通路、平面细胞极性通路的正调控、细胞生长的负调控、平滑肌细胞迁移的负调控、凋亡过程、内皮细胞迁移的正调控、信号转导的负调控等。增强的功能主要和炎症相关，减弱的功能主要和细胞增殖、平滑肌细胞和内皮细胞相关。KEGG分析发现：上调的有37个，下调的有88个；高级分类含有的显著性Pathway数目较多的包括“人类疾病”有关；中级分类含有心血管疾病，这也和OSA与心脑血管发病率的增加有关相吻合。

综上所述，本研究发现了CIH诱导的OSA鼠模型的差异表达基因，为研究lncRNAs在OSA诱导的心血管疾病中的作用奠定了基础。