重楼皂苷Ⅶ对人皮肤鳞状细胞癌裸鼠移植瘤生长的影响及作用机制

杨春华，时洁，唐凤，王婧，张震

（1.恩施土家族苗族自治州中心医院，湖北 恩施 445000；2.河西学院附属张掖人民医院，甘肃 张掖 734000）

人皮肤鳞状细胞癌（Cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC）主要发生于人体皮肤的鳞状上皮组织，是我国常见的皮肤恶性肿瘤之一[1]。尽管很少致命，但cSCC通过功能障碍、损害容貌以及由此导致的社会心理问题严重降低患者的生活质量。且cSCC多发于60岁及以上的人群中，随着老年人口的增加cSCC发病率会迅速增加[2]。因此，cSCC对医疗保健成本的影响越来越大。cSCC的一般治疗选择包括手术、放疗和化疗等。然而，cSCC的预后，特别是对于那些患有晚期疾病的患者，效果并不令人满意[3]。基于此，开发用于治疗cSCC的新颖有效的药物有重大意义。

中草药重楼有退热解毒、消肿止痛、养肝定惊等作用，在中医中已用于多种疾病治疗[4]。现代药理表明重楼的化学成分包括甾体皂苷、植物蜕皮激素、植物甾醇、类黄酮和脂肪酸酯等[5]。有研究表明，甾体皂苷是重楼发挥各种药理作用的主要生物活性成分[6]。目前，已经从重楼中分离并鉴定116种甾体皂苷。其中重楼皂苷Ⅶ（Polyphyllin Ⅶ，PP Ⅶ）有抗炎、抗癌活性，已在多种癌症类型中表现出强大的抑癌作用，如结肠癌[7]、肺癌[8]和胶质瘤等[9]。但其在cSCC中的作用及机制尚不明确，因此本研究通过构建cSCC裸鼠模型，观察PP Ⅶ对移植瘤的影响并探讨其作用机制，为cSCC新型治疗方法提供依据。

1 材料与方法

1.1 一般材料 8～10周龄无特定病原（SPF）级白变种实验室老鼠（BALB/c）雌性裸鼠购买自中国科学院上海药物研究所[SCXK（沪）2019-0001]；cSCC A431细胞株购买自中国上海中科院细胞库；PP Ⅶ购买自美国 Sigma Aldrich；原位末端标记技术（TUNEL）试剂盒购买自上海博耀生物科技有限公司；Ki67、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）免疫组化试剂盒购买自上海谷研实业有限公司；洛斯维·帕克纪念研究所研发的培养基（RPMI）1640、胰蛋白酶购买自美国 Gibco；胎牛血清购买自以色列BI；天冬氨酸特异性蛋白酶 3（Caspase-3，66470-2-Ig）、切割后（cleaved）-Caspase-3（66520-1-Ig）、B 淋巴细胞瘤-2（Bcl-2，60178-1-Ig）、Bcl-2 相关 X 蛋白 （Bax，60267-1-Ig）、Notch1（20687-1-AP）、发状分裂相关增强字-1（Hes-1，10597-1-AP）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH，60004-1-Ig）抗体购买自美国Proteintech Group公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 取出低温冻存A431细胞，置于37℃水浴条件下融化，冻存液部分溶解时取出，在无菌操作台下吸取冻存液加入适量培养基混匀后离心去上清液，加入适量添加有10% 胎牛血清的RPMI 1640完全培养基重悬细胞，于37℃、5% 二氧化碳（CO2）浓度条件下恒温培养。显微镜观察培养细胞，细胞铺满培养瓶80% ～90% 时进行传代培养。加入适量0.25% 胰蛋白酶对培养细胞进行消化处理3～5min，用完全培养基终止消化反应，重悬细胞并计数，以RPMI1640培养基稀释至1×108个/mL备用。

1.2.2 裸鼠移植瘤模型构建 25只裸鼠适应性培养 1 周后，将 100 μL A431 细胞悬液（1×108个/mL）接种于裸鼠右侧腋窝皮下，接种1周后，接种部位明显瘤状隆起视为造模成功。接种2周后，将造模成功的裸鼠随机分为对照组、PP Ⅶ0.5、1、2 mg/kg组、阳性对照氟尿嘧啶（5-FU）10 mg/kg组，每组各5只。按照组别对应分别给予腹腔注射0.5、1、2mg/kg PP Ⅶ或10 mg/kg 5-FU，对照组腹腔注射等量生理盐水，1次/d，连续注射30 d。药物剂量选择依据相关文献[10]。分别与药物注射后 5、10、15、20、25、30 d使用游标卡尺测量移植瘤最长径（L，mm）与最短径（S，mm），根据公式 V（mm3）=L×S2×π/6计算体积。30 d后处死裸鼠，取出移植瘤检测移植瘤质量。

1.2.3 TUNEL染色检测细胞凋亡 对各组移植瘤进行常规固定包埋，切片，脱蜡后使用二甲苯浸洗2次，5 min/次；使用梯度浓度乙醇（100、95、90、80、70%）依次浸洗3 min；加入适量蛋白酶K室温孵育30 min，磷酸盐缓冲液（PBS）清洗2次；按 TUNEL试剂盒说明书混合各试剂，加入50 μL TUNEL混合反应液于玻片标本上，置于湿盒中37℃反应1 h，PBS清洗3次；滤纸吸干水分，加入50 μL converter-POD于玻片标本上，置于湿盒中37℃反应30 min，PBS清洗3次；滤纸吸干水分，加入50～100 μL二氨基联苯胺（DAB），室温反应10 min，PBS清洗3次；加入苏木素复染，几秒后流水充分冲洗，脱水、透明、封片。结果判定：细胞核为棕黄色即为凋亡细胞，每切片随机取400倍显微镜视野5个，分别对凋亡细胞及总细胞进行计数，计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=（凋亡细胞数/总细胞数）×100% 。

1.2.4 免疫组化检测Ki67、VEGF 各组移植瘤切片常规脱蜡水化，细胞通透液浸润玻片30 min，PBS清洗3次；将玻片放入0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲液（pH6.0）中微波修复抗原，PBS清洗3次；加入3% 过氧化氢（H2O2）溶液孵育30 min以阻断内源性过氧化酶，PBS清洗3次；加入5% 血清（与二抗来源一致）置于湿盒中室温封闭20 min；滤纸吸干血清，加入50 μL适当比例稀释Ki67、VEGF一抗，4℃孵育过夜，PBS清洗5次；加入二抗室温孵育30 min～1 h，PBS清洗5次；滴加过氧化物酶标记的链霉亲和素（SP）室温孵育30 min～1 h，PBS清洗5次；滤纸吸干水分，加入50～100 μL DAB，室温反应10 min，PBS清洗3次；加入苏木素复染，几秒后流水充分冲洗，脱水、透明、封片。免疫组化结果判定：细胞内有棕黄色颗粒即为蛋白阳性表达细胞，每切片随机取400倍显微镜视野5个，分别对阳性细胞及总细胞进行计数，计算阳性细胞率。阳性细胞率=（阳性细胞数/总细胞数）×100% 。

1.2.5 蛋白免疫印迹（WB）法检测蛋白表达水平 提取各组移植瘤蛋白，按照聚氰基丙烯酸正丁酯（BCA）法使用试剂盒测定蛋白质浓度；根据测量浓度加入相应体积的待测样品于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）中，以25 mA恒定电流电泳1～2 h；将凝胶转印到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，浸入封闭液中2 h，用Tris缓冲盐溶液+Tween 20（TBST）清洗膜3次，3 min/次；加入适当比例稀释的Caspase-3、Bax、Bcl-2、Notch1、Hes-1 蛋白一抗，4 ℃孵育过夜，TBST清洗膜3次；加入对应浓度二抗，室温孵育2 h，TBST清洗膜3次；避光加入ECL发光染色，使用凝胶成像仪进行成像分析。采用TotalLab2.0进行灰度分析，以GAPDH作为内参，计算蛋白的相对表达量。

1.3 统计学分析 使用SPSS 20.0统计学软件进行统计处理。计量资料以（±s）表示，2组比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PP Ⅶ抑制cSCC移植瘤生长 药物注射30 d后，与对照组相比，随着PP Ⅶ注射剂量的增加，移植瘤逐渐变小并接近5-FU10mg/kg组水平，见图1A；PP Ⅶ1、2 mg/kg组、5-FU 10 mg/kg组移植瘤质量、体积显著低于对照组（P＜0.05），见图1B、C。随着PP Ⅶ注射剂量的增加和注射时间的延长，cSCC移植瘤生长曲线越加平缓；与对照组相比，各PP Ⅶ组移植瘤生长受到不同程度的抑制，且PP Ⅶ2 mg/kg组抑制作用最明显并接近5-FU 10 mg/kg组水平，见图1C。

图1 PP Ⅶ抑制cSCC移植瘤生长

2.2 PP Ⅶ诱导cSCC移植瘤细胞凋亡 TUNEL染色结果表明，药物注射30 d后，对照组棕黄色凋亡细胞较少，随着PP Ⅶ注射剂量的增加，棕黄色凋亡细胞逐渐增多并接近5-FU 10 mg/kg组水平，见图2A；PP Ⅶ 1、2 mg/kg组、5-FU 10 mg/kg组细胞凋亡率显著高于对照组（P＜0.05），见图2B。

图2 PP Ⅶ诱导cSCC移植瘤细胞凋亡

2.3 蛋白印迹法检测各组移植瘤Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达水平 蛋白印迹结果显示，随着PP Ⅶ注射剂量的增加，Bax、Caspase-3蛋白表达量逐渐增加，Bcl-2蛋白表达水平逐渐降低并接近5-FU 10 mg/kg组水平，见图3A；PP Ⅶ 1、2 mg/kg组、5-FU 10 mg/kg组Bax/Bcl-2值和cleaved Caspase-3/Caspase-3值显著高于对照组（P＜0.05），见图3B。

图3 各组移植瘤Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达水平

2.4 免疫组化检测各组cSCC移植瘤细胞Ki67、VEGF蛋白表达情况 免疫组化结果显示，对照组有大量含有棕黄色颗粒细胞，Ki67、VEGF蛋白阳性表达率较高，随着PP Ⅶ注射剂量的增加，Ki67、VEGF蛋白阳性表达细胞数量逐渐减少并接近5-FU 10 mg/kg组水平，见图4A、C；PP Ⅶ 1、2 mg/kg组、5-FU 10 mg/kg组Ki67、VEGF蛋白阳性细胞率显著低于对照组（P＜0.05），见图4B、D。

图4 各组移植瘤细胞Ki67、VEGF蛋白表达情况

2.5 WB法检测各组移植瘤Notch1、Hes-1蛋白表达水平 蛋白印迹结果显示，随着PP Ⅶ注射剂量的增加，Notch1、Hes-1蛋白表达量逐渐增加，见图5A；PP Ⅶ 1、2 mg/kg组、5-FU 10 mg/kg组 Notch1、Hes-1蛋白表达量显著高于对照组（P＜0.05），见图5B。

图5 各组移植瘤Notch1、Hes-1蛋白表达水平

3 讨论

作为第二大最常见的皮肤癌，cSCC是一种高度流行的恶性肿瘤，在大多数情况下，可通过手术切除来治愈。但是，约3% 的患者会发生区域淋巴结转移，显著降低患者5年生存率[11]，因此探索新的治疗药物有重要意义。近年来，PP Ⅶ的抗癌作用与机制已在多种癌症研究中报道。本研究通过构建cSCC裸鼠移植瘤模型，对各组移植瘤体积、质量、生长情况进行观察比较，发现与对照组相比，PP Ⅶ各组移植瘤生长速度、质量、体积显著降低，说明使用PP Ⅶ能在一定程度上抑制cSCC移植瘤的生长，并且这种抑制作用随PP Ⅶ用药剂量增加而加强；同时，PP Ⅶ2 mg/kg组与5-FU 10 mg/kg组移植瘤大小、质量相近，表明高剂量PP Ⅶ的抑癌作用已与5-FU相当。

恶性肿瘤较强的抗凋亡能力和促增殖能力是其发生发展的关键。Zhang等[12]证明PP Ⅶ能通过触发线粒体介导的ROS生成以及激活MAPK和PTEN/p53途径诱导肝癌细胞凋亡。Lin等[13]报道PP Ⅶ通过诱导细胞周期停滞并触发凋亡，对肺癌细胞生长表现出强抑制作用。本研究通过TUNEL染色检测细胞凋亡，结果显示随着PP Ⅶ注射剂量的增加，细胞凋亡率增加，PP Ⅶ1、2 mg/kg组、5-FU 10 mg/kg组细胞凋亡率显著高于对照组，且PP Ⅶ2 mg/kg组与5-FU 10 mg/kg组细胞凋亡率差异无统计学意义。Bax、Bcl-2是调控细胞凋亡相关基因，但二者生理功能相反，Bax促凋亡，Bcl-2抗凋亡。Bax、Bcl-2蛋白水平比例能反应细胞凋亡状况，Bax/Bcl-2值越高，细胞凋亡发生率越高[14]。Caspase-3是内源性和外源性凋亡途径必须的关键蛋白，其可在上游信号分子作用下裂解生成有活性的cleaved Caspase-3，进而降解多种蛋白并在细胞凋亡过程中形态改变和DNA断裂中起到作用[15]。在本研究中WB结果显示，随着PP Ⅶ注射剂量的增加，Bax、Caspase-3蛋白表达量逐渐增加，Bcl-2蛋白表达水平逐渐降低，PP Ⅶ 1、2 mg/kg组、5-FU 10 mg/kg组Bax/Bcl-2值和cleaved Caspase-3/Caspase-3值显著高于对照组，且PP Ⅶ2 mg/kg组与5-FU 10 mg/kg组Bax/Bcl-2值和cleaved Caspase-3/Caspase-3值差异无统计学意义。Ki67是一种核蛋白，可指示细胞增殖的程度。cSCC的预后与高水平的Ki67表达活性之间存在显著关联[16]。另一方面，肿瘤血管形成在肿瘤形成过程中起着重要作用，对于肿瘤的进展和实体瘤的转移扩散至关重要。VEGF被认为是肿瘤血管生成过程中最重要的血管生成调节因子之一[17]。本研究中，免疫组化结果显示，随着PP Ⅶ注射剂量的增加，Ki67、VEGF蛋白阳性表达细胞数量逐渐减少，PP Ⅶ 1、2 mg/kg组、5-FU 10 mg/kg 组Ki67、VEGF蛋白阳性细胞率显著低于对照组，且PP Ⅶ 2 mg/kg组与 5-FU 10 mg/kg组 Ki67、VEGF蛋白阳性细胞率差异无统计学意义。这些结果表明PP Ⅶ有促进cSCC细胞凋亡和抑制cSCCA细胞增殖的能力，并且作用效果随剂量增加而加强，高剂量条件下促凋亡和抗增殖效果与5-FU相当。

Notch信号传导是细胞内通讯的一种重要形式，在细胞分化、生存、增殖中起着关键作用[18]。在角质形成细胞中，其诱导分化并抑制肿瘤的发展，其在角质形成细胞中的缺失会增强对皮肤癌形成的敏感性[19]。而Notch通路激活能促进cSCC细胞凋亡和抑制cSCC细胞增殖[20]。Notch受体被配体激活后，γ-分泌酶会对Notch的胞内结构域进行切割，细胞内裂解的Notch易位至细胞核，与DNA结合蛋白RBP-J形成复合物，并激活许多靶基因的转录，包括Hes转录因子家族[21]。Hes-1在Notch1信号调控下，与相应的靶基因结合，调控基因转录进而发挥生理功能。在本研究中，随着PP Ⅶ注射剂量的增加，Notch1、Hes-1蛋白表达量逐渐增加，表明PP Ⅶ能激活Notch1/Hes-1通路，促进cSCC细胞凋亡。

综上所述，PP Ⅶ能促进cSCC细胞凋亡，抑制cSCC细胞增殖，这可能与其能激活Notch1/Hes-1信号通路有关，突出表明PP Ⅶ用于cSCC治疗的潜在价值。