四妙汤调节JNK信号通路对压力性损伤大鼠的保护作用研究

付晓晓，张宇洁，张雪峰

（1.乌鲁木齐市中医医院，新疆维吾尔自治区 乌鲁木齐 830000；2.新疆生产建设兵团医院，新疆维吾尔自治区 乌鲁木齐 830002）

压力性损伤（Pressure injury，PI）又称为压疮，是一种发生在骨隆突处的局限性损伤，是由于皮肤或皮下组织受压力或复合有剪切力或/和摩擦力引起的以皮肤、肌肉和皮下组织局限性损伤和坏死为特征的一种疾病，由于目前临床上对于PI的治疗药物及方法有限，寻找有效安全的药物仍是目前的工作重点之一[1-2]。四妙汤出自中国传统医学著作《圣济总录》，有清热解毒，活血化瘀之功效，主要用于治疗痈疽发背，无名肿毒等疾病[3-4]，而对于四妙汤作用于PI的作用及机制，目前尚无明确报道。c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路是参与细胞生长、增殖等生命活动的重要信号通路，近年来研究表明皮肤损伤的愈合与JNK信号通路密切相关[5-7]。本文通过建立PI大鼠模型，研究四妙汤对于PI大鼠的保护作用及机制，为PI的治疗提供新的参考及依据。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠，无特定病原（SPF）级别，6 周龄，体质量（180±20）g，购自新疆医科大学动物实验中心，动物房温度（22±2）℃，湿度（50±10）% ，适应性喂养1周后进行实验；四妙汤配方颗粒购自北京康仁堂药业有限公司；黄芪注射液购自神威药业集团有限公司；JNK、p-JNK和GAPDH抗体均购自美国Proteintech公司；核糖核酸（RNA）提取试剂盒、放射免疫沉淀分析（RIPA）蛋白裂解液、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）测定及IL-1β检测酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自上海碧云天公司；ECL显色液购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；酶标仪购自美国Beckman Coulter公司；双垂直电泳仪、转印电泳仪购自北京海天友诚科技有限公司；凝胶成像仪均购自伯乐生命医学产品有限公司；全自动生化分析仪购自美国贝克曼库尔特有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PI大鼠模型的建立及给药 SD大鼠36只，除6只作为对照组外，其余大鼠参照文献方法建立PI大鼠模型[8-9]，具体方法为：根据大鼠体质量按照3 mL/kg腹腔注射给予大鼠10% 水合氯醛麻醉后，常规备皮、消毒，沿大鼠臀部作切口，植入直径16 mm、厚2 mm的磁片，缝合、消毒后肌肉注射给予80万U青霉素预防感染，术后24 h，利用外源性磁铁引力加压造成局部缺血，2 h后取下外源磁铁，间隔30 min重复以上步骤，3次/d，术后所有大鼠采用单笼正常喂养，对照组大鼠只备皮不做特殊处理。手术4 d后，大鼠受压皮肤变黑、变硬，用针刺不出血时，视为造模成功。将造模完成后的大鼠随机分为5组，每组6只，分别为模型组、四妙汤低剂量组、四妙汤中剂量组、四妙汤高剂量组及阳性对照组。用透明硫酸铜板纸贴在PI皮肤表面，用笔在纸上描出大鼠PI轮廓，记为初始损伤面积A0。根据大鼠体质量，四妙汤低、中、高剂量组大鼠分别按照25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg 灌胃给予大鼠四妙汤，阳性对照组按照10 mL/kg腹腔注射给予大鼠黄芪注射液[10]，对照组及模型组灌胃给予大鼠相同剂量的生理盐水，所有组别给药1次/d，连续给药21 d，最后一次给药24 h后进行后续实验。

1.2.2 大鼠PI组织愈合率的测定 用笔在透明硫酸铜板纸上描出大鼠PI轮廓，记为A1。用Image J软件处理后按照公式：伤口愈合率（%）=（1-A1/A0）×100% ，计算大鼠PI组织愈合率。

1.2.3 大鼠血清SOD、MDA水平的测定 大鼠眼眶后静脉丛取血，静置、离心3 min（速度为3 000 r/min，半径为15 cm）、取上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测大鼠血清SOD、MDA水平。

1.2.4 大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平测定大鼠麻醉后腹主动脉取血，静置、离心3 min（速度为3 000 r/min，半径为15 cm），取血清，使用全自动生化分析仪检测血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平。

1.2.5 实时定量聚合酶链式反应（PCR）检测大鼠PI组织c-Jun、AP-1 mRNA水平 大鼠处死后取背部PI皮肤组织，提取损伤组织总RNA，逆转录成cDNA后，使用实时定量PCR试剂盒检测β-actin、c-Jun及AP-1 mRNA的水平。基因引物见表1，结果以 2-ΔΔCt法计算表达量。

表1 各基因引物序列

1.2.6 HE染色 大鼠处死后取PI组织放入10% 中性甲醛中固定，石蜡包埋后制成5 μm石蜡切片，常规HE染色后在光学显微镜下观察。

1.2.7 蛋白免疫印迹（WB）法检测大鼠PI组织JNK、p-JNK水平 取大鼠背部PI组织，使用蛋白裂解液研磨匀浆后，离心3 min（速度为3 000 r/min，半径为15 cm），取上清并测定蛋白浓度，取60 μg蛋白进行电泳分离，转膜后取所需相对分子质量蛋白进行切膜，经 JNK、p-JNK 及 GAPDH 抗体（1∶1 000稀释）孵育后，加入二抗（1∶2 000）室温孵育 1 h，显色液显影后在凝胶成像系统成像并应用Image J软件定量分析。

1.3 数据处理 各项指标数据使用SPSS 19.0分析，Graphpad Prism 5作图，计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四妙汤对PI大鼠组织愈合的影响 各组大鼠PI组织愈合率，与模型组相比，四妙汤低、中、高剂量组及阳性对照组大鼠PI组织愈合率均显著升高（P<0.05），见表2、图1。

表2 各组大鼠PI组织愈合率 （% ，±s）

表2 各组大鼠PI组织愈合率 （% ，±s）

注：a与模型组相比，P<0.05。

组别 n 愈合率对照组 6 -模型组 6 38.78±2.64四妙汤低剂量组 6 52.58±3.81a四妙汤中剂量组 6 68.94±2.68a四妙汤高剂量组 6 79.68±3.31a阳性对照组 6 60.11±3.74a

图1 大鼠PI组织愈合率

2.2 四妙汤对PI大鼠血清超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平的影响 各组大鼠血清SOD、MDA水平与对照组相比，模型组PI大鼠血清SOD显著降低（P<0.05），MDA 水平显著升高（P<0.05），提示PI发病机制与大鼠血清SOD、MDA水平密切相关；与模型组相比，四妙汤低、中、高剂量组及阳性对照组大鼠血清SOD水平均显著升高（P<0.05），MDA水平显著降低（P<0.05），见表3、图2。

表3 各组大鼠血清SOD、MDA水平 （±s）

表3 各组大鼠血清SOD、MDA水平 （±s）

注：与对照组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05。

组别 n S O D（μ g/m g p r o t） M D A（n m o l/m g p r o t）对照组 6 4 0.4 6±3.7 7 1.3 8±0.5 1模型组 6 2 6.7 7±1.5 8a 8.3 8±1.1 2a四妙汤低剂量组 6 3 3.8 9±1.6 1ab 5.1 6±0.7 7ab四妙汤中剂量组 6 3 6.5 9±1.9 1ab 3.3 9±0.4 6ab四妙汤高剂量组 6 4 0.6 9±1.4 8b 1.9 7±0.9 7ab阳性对照组 6 3 8.3 1±1.0 3b 3.2 7±0.8 4b

图2 大鼠血清SOD、MDA水平

2.3 四妙汤对PI大鼠血清炎性因子水平的影响各组大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平与对照组相比，模型组PI大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平均显著升高（P<0.05），提示PI大鼠发病机制与血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平密切相关；与模型组相比，四妙汤低、中、高剂量组及阳性对照组大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平均显著降低（P<0.05），见表4、图3。

表4 各组大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β 水平 （pg/mL，±s）

表4 各组大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β 水平 （pg/mL，±s）

注：与对照组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05。

组别 n TNF-α IL-6 IL-1β对照组 6 14.78±1.23 31.78±1.61 19.93±1.86模型组 6 43.57±1.68a 131.54±1.73a 56.19±2.13a四妙汤低剂量组 6 31.34±2.19ab 71.72±2.43ab 42.33±1.64ab四妙汤中剂量组 6 24.71±1.84ab 56.67±1.88ab 35.71±1.87ab四妙汤高剂量组 6 15.12±1.44b 38.42±1.69ab 21.03±2.28b阳性对照组 6 20.91±1.31b 44.65±2.03ab 27.19±1.87b

图3 大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平

2.4 四妙汤对PI大鼠c-Jun、AP-1 mRNA水平的影响 各组大鼠c-Jun、AP-1 mRNA水平与对照组相比，模型组PI大鼠损伤组织c-Jun、AP-1 mRNA水平显著升高（P<0.05）；与模型组相比，四妙汤各剂量组及阳性对照组大鼠损伤组织c-Jun、AP-1 mRNA 水平显著降低（P<0.05），见表5、图4。

表5 各组大鼠c-Jun、AP-1 mRNA水平 （±s）

表5 各组大鼠c-Jun、AP-1 mRNA水平 （±s）

注：与对照组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05。

组别 n c-Jun AP-1对照组 6 0.88±0.33 0.58±0.23模型组 6 2.83±0.73a 1.94±0.38a四妙汤低剂量组 6 1.69±0.46ab 1.52±0.44ab四妙汤中剂量组 6 1.21±0.33ab 1.17±0.35ab四妙汤高剂量组 6 0.96±0.27b 0.67±0.23b阳性对照组 6 1.03±0.67b 0.94±0.17b

图4 大鼠c-Jun、AP-1 mRNA水平

2.5 组织病理学检查 各组大鼠组织病理学检查与对照组相比，模型组大鼠PI组织结构不清晰，复层鳞状上皮变薄，细胞排列不整齐，存在大量炎性浸润，与模型组相比，四妙汤各剂量组及阳性对照组大鼠皮肤组织病理学明显改善，四妙汤低、中剂量组大鼠PI组织细胞排列较整齐，可见少量炎性细胞浸润，四妙汤高剂量组大鼠皮肤组织结构完整，细胞排列整齐，偶见炎性细胞浸润，见图5。

图5 各组大鼠组织病理学检查结果（HE染色×100）

2.6 四妙汤对PI大鼠JNK、p-JNK水平的影响 各组大鼠JNK、p-JNK水平与对照组相比，模型组大鼠PI组织JNK、p-JNK水平显著升高（P<0.05）；与模型组相比，四妙汤各剂量组及阳性对照组大鼠PI组织JNK、p-JNK水平显著降低（P<0.05），见图6。

图6 各组大鼠JNK、p-JNK水平

3 讨论

PI的发病机制尚不明确，目前普遍认为是由压力、剪切力和摩擦力与多种内外因素共同作用下以局部组织缺血/再灌注损伤为主引起的微循环破坏、氧化应激损伤、功能性毛细血管网密度减少以及大量细胞的凋亡，最终导致局部组织溃疡或坏死[1-2]。目前临床上主要使用促进血管再生、缓解氧化应激损伤、抑菌繁殖和调控免疫反应等药物进行治疗[11-12]，但由于长期使用不良反应大等原因，对于PI的治疗仍是目前急需解决的问题。

四妙汤主要由紫草茸、升麻、甘草等中草药组成，用于治疗痈疽发背，肠痈乳痈，无名肿毒，焮红疼痛，憎寒壮热，状若伤寒者[13]。近年来研究表明，四妙汤有保护血管、抗炎、抗氧化、抗高尿酸血症、肾脏保护等作用[14]，而四妙汤对PI的作用及机制目前尚未见文献报道。

JNK又被称为应激活化蛋白激酶（SAPK），是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路的一个重要分支，与细胞周期、生殖、凋亡和细胞应激等多种生理活动密切相关。JNK信号通路位于细胞质中，被激活后能够迅速转移进入细胞核，诱发机体内炎性因子的大量释放，同时激活活化转录因子c-Jun、AP-1等基因，诱发与凋亡有关的基因的过度表达，从而影响细胞的正常生命活动[15]。近年来研究表明，JNK信号通路与皮肤组织损伤的发病机制与愈合密切相关[16]。

本文通过采用植入磁片循环压迫法建立大鼠PI模型，然后连续21 d后给予大鼠不同剂量的四妙汤，结果表明，与模型组相比，四妙汤各剂量组PI大鼠组织愈合率显著提高，提示四妙汤能够显著提高大鼠PI组织愈合率，促进大鼠PI后创面的愈合，缩短大鼠PI愈合时间；血清SOD及MDA水平是反应机体氧化应激损伤的直接的指标，同时TNF-α、IL-6及IL-1β水平是反应机体炎性反应状态的重要指标，本研究结果表明，四妙汤各剂量组PI大鼠血清SOD水平显著升高，血清MDA、TNF-α、IL-6及IL-1β水平均显著降低，提示四妙汤能够显著降低PI大鼠血清炎性因子水平，改善大鼠损伤组织的炎性反应及应激状态，加速损伤组织的愈合；实时定量PCR及WB结果表明，PI组织c-Jun、AP-1 mRNA水平显著降低，大鼠PI组织JNK、p-JNK水平显著降低，提示四妙汤能够显著降低大鼠PI组织c-Jun、AP-1 mRNA水平，抑制c-Jun、AP-1的转录激活，进而抑制JNK通路及相关蛋白的的过表达，缓解PI大鼠的组织愈合状态。

综上所述，四妙汤能够降低PI大鼠氧化应激及体内炎性因子水平，促进大鼠PI组织的恢复，其机制可能与调节JNK信号通路有关。