不同中药色素对C57BL/6小鼠触须毛囊体外培养的研究

马东雪，杨志波，林浩，汪海珍，李明鑫，黄盼，黎滢，张予晋

（1.大连市皮肤病医院，辽宁 大连 116021；2.湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410005）

近年来脱发疾病的发病率逐年升高，毛发异常直接造成损容性外观，影响患者的生活社交。目前对脱发疾病治疗尚缺少简便易廉、疗效稳定的方法，故毛发相关研究已成为皮肤科研究的一个重要方向。课题组通过研究治疗脱发常用中药红花、生姜、紫草的提取物红花黄色素、姜黄素及紫草素在不同浓度时对小鼠离体毛囊生长的影响和作用机制，探索可以促进毛囊生长的中药色素成分，为脱发疾病的治疗提供了新的临床和科研方向。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料和设备 齐墩果酸（北京索莱宝生物有限公司，批号：YZ-110790）、红花黄色素（西安利时生物科技有限公司，批号：20180210）、姜黄素（北京索莱宝生物有限公司，批号：YZ-110823）、紫草素（陕西斯诺特生物技术有限公司，批号：SNT180317）、生理盐水、磷酸盐缓冲液（PBS）、庆大霉素、青链霉素、氢化可的松、高糖型细胞培养基（DMEM HIGH）、新生牛血清、噻唑蓝（MTT）、75% 乙醇、各种规格注射器、各种规格离心管、手术刀柄、手术刀片、显微外科镊、显微外科剪、细胞培养皿、无菌橡胶手套、无菌托盘、48孔培养板、显微镜、荧光倒置相差显微镜、超净工作台、细胞培养箱、小型水平摇床、多模式读板仪、头戴式放大镜、微量移液器、FB224自动内校分析天平。

实验动物：C57BL/6雄性小鼠，日龄30～40 d，体质量15 g左右，无特定病原（SPF）级，[动物生产许可证编号：SCXK-（湘）2016-0002]。饲养于中南大学动物学部。

1.2 方法

1.2.1 培养基的制备 瓶装液体DMEM培养基，在DMEM培养基中加入10% 新生牛血清、0.4 μg/mL氢化可的松、40 U/mL庆大霉素、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素。密封，置于4℃冰箱保存。

1.2.2 小鼠触须毛囊的分离 4% 水合氯醛腹腔麻醉，剪去双侧胡须，上唇部络合碘消毒3次，75% 乙醇脱碘2次，无菌生理盐水冲洗1次，注射生理盐水至双侧胡须垫皮下使其肿胀，15号手术刀片无菌条件下划开双侧胡须垫，显微外科剪剪取胡须垫，置无菌PBS冲洗3次，10倍放大镜下顺毛囊方向，将毛囊与周围组织逐一分离，操作时需固定毛干避免伤及毛乳头和真皮组织鞘等组织，PBS冲洗3遍，分离后的毛囊置于装有PBS的细胞培养皿中待培养，双侧胡须垫共可分离15～20只毛囊，选取完整且处于生长初期毛囊用以培养。

1.2.3 细胞培养实验分组 红花黄色素、姜黄素、紫草素分别设置低中高3个浓度，浓度分别为3、10、30，130 μg/mL齐墩果酸为阳性对照组，生理盐水为阴性对照组。共分为11组，每组3个孔，每孔1个毛囊，具体分组见表1。

表1 色素培养实验分组 μg/mL

1.2.4 混合色素实验分组 根据第一步实验结果，筛选出促进毛囊生长的相对最佳色素浓度30 μg/mL红花黄色素、10 μg/mL 姜黄素、30 μg/mL 紫草素，将其进行正交实验。具体分组见表2。

表2 混合色素正交实验分组

1.2.5 游离毛囊的培养 游离毛囊培养于48孔细胞培养板，每个色素浓度选取3孔，每孔放置1个毛囊并加入0.5mL DMEM，在37℃、5% 二氧化碳（CO2）条件下培养，24 h后选取生长长度≥0.1 mm毛囊继续培养，逐一按分组浓度加入各色素，期间无需更换培养基连续培养8 d。

1.3 观察指标

1.3.1 游离毛囊的观察 在毛囊培养的第1、2、4、6、8天，于荧光倒置显微镜下观察并拍照，采用Adobe Photoshop CS3软件测量毛囊底部到毛干顶部的距离，2次测量结果的差值作为毛囊的生长长度，并计算出毛囊生长长度的平均值。同时在镜下观察毛球部的组织形态变化。

1.3.2 MTT实验 在毛囊培养的第8天取出对应组毛囊，向待测孔中加10 μL MTT溶液。37℃恒温培养箱中孵育4 h，吸除孔内培养液。每孔加100 μL二甲基亚砜（DMSO）溶液，置摇床上低速振荡10min，充分溶解结晶物。30 min后，用多功能酶标仪检测各组样品在490 nm处的吸光值。

1.4 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计学处理，用±s对资料进行描述，采用单因素方差分析及独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度色素对小鼠触须毛囊生长长度的影响 干预后第2、4、6天观察毛囊生长长度，各浓度中药色素与2个对照组比较差异均无统计学意义；第 8 天观察，30 μg/mL 的红花黄色素、3 μg/mL 和10 μg/mL的姜黄素、30 μg/mL 的紫草素均能更好的促进毛囊生长，与阴性对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），其中10 μg/mL的姜黄素促进毛囊生长效果最佳，与其它不同浓度色素组组间差异有统计学意义（P<0.05），所有色素组与阳性对照组比较差异均无统计学意义。见表3。

表3 各色素不同浓度对小鼠触须毛囊生长长度的影响 （mm，±s）

表3 各色素不同浓度对小鼠触须毛囊生长长度的影响 （mm，±s）

注：▲与阴性组对照差异有统计学意义，P<0.05；★与其它不同浓度色素组对照差异有统计学意义，P<0.05。

2 d 4 d 6 d 8 d齐墩果酸（阳性） 0.29 0.31 0.32 0.35 1.27±0.11生理盐水（阴性） 0.24 0.32 0.26 0.25 1.07±0.04红花黄色素 3 μg/mL 0.23 0.29 0.27 0.25 1.04±0.06红花黄色素 10 μg/mL 0.25 0.31 0.27 0.25 1.08±0.04红花黄色素 30 μg/mL 0.29 0.33 0.31 0.29 1.22±0.04▲姜黄素 3 μg/mL 0.27 0.32 0.33 0.31 1.21±0.02▲姜黄素 10 μg/mL 0.41 0.38 0.36 0.43 1.58±0.70▲★姜黄素 30 μg/mL 0.22 0.33 0.25 0.25 1.05±0.30紫草素 3 μg/mL 0.27 0.32 0.33 0.31 1.04±0.05紫草素 10 μg/mL 0.41 0.38 0.36 0.43 1.09±0.09紫草素 30 μg/mL 0.22 0.33 0.25 0.25 1.24±0.07▲组别 小鼠触须毛平均增长长度 小鼠触须最终生长长度

2.2 不同浓度色素对小鼠触须毛囊细胞活力的影响 MTT比色法结果示，干预第8天，30 μg/mL的红花黄色素、10 μg/mL 的姜黄素、30 μg/mL 的紫草素所培养的毛囊细胞活力较好，与阴性对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。30 μg/mL的姜黄素培养的毛囊细胞活力明显减弱，与2个对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。各色素在不同浓度下（除外30 μg/mL的姜黄素）所培养毛囊的细胞活力与阳性对照组比较差异无统计学意义。见表4。

表4 不同色素对小鼠触须毛囊细胞活力的影响 （±s）

表4 不同色素对小鼠触须毛囊细胞活力的影响 （±s）

注：▲与阴性组对照差异有统计学意义，P<0.05；★与阳性组对照差异有统计学意义，P<0.05。

组别 吸光度值（O D）红花黄色素 3 μ g/m L 0.3 5±0.0 4红花黄色素 1 0 μ g/m L 0.5 0±0.1 0红花黄色素 3 0 μ g/m L 0.5 9±0.0 3▲紫草素 3 μ g/m L 0.4 2±0.1 0紫草素 1 0 μ g/m L 0.4 5±0.0 8紫草素 3 0 μ g/m L 0.6 2±0.0 3▲姜黄素 3 μ g/m L 0.3 7±0.0 7姜黄素 1 0 μ g/m L 0.6 5±0.0 3▲姜黄素 3 0 μ g/m L 0.2 2±0.0 4▲★齐墩果酸 0.5 5±0.0 8生理盐水 0.4 3±0.1 4

2.3 毛囊体外培养直观图 开始培养第4天时，各实验组与对照组比较差异无统计学意义，均处于生长期。开始培养第8天时，对照组毛囊毛球体积变小且毛乳头细长，透明度增加，毛囊已处于退化期，而 30 μg/mL 红花黄色素、10 μg/mL 姜黄素、30 μg/mL紫草素组毛囊毛球形态圆润且结构致密，毛乳头色黑，体积无明显缩小，毛囊仍处于生长期，说明红花黄色素、姜黄素、紫草素均可显著延长毛囊的生长期。图片显示姜黄素组毛囊开始培养第8天毛乳头颜色最深，黑素含量多、黑素细胞最多。结果表明红花黄色素与紫草素在30 μg/mL、姜黄素在10 μg/mL时促进毛囊的生长效果最佳，且与MTT细胞活力检测实验结果一致。见图1。

图1 毛囊体外培养图片

2.4 不同混合组合对小鼠触须毛囊生长的影响 各种不同浓度中药色素混合后均不能更好促进毛囊的生长，与阴性对照组比较差异无统计学意义。见表5。

表5 混合组对小鼠触须毛囊生长长度的影响 （mm，±s）

表5 混合组对小鼠触须毛囊生长长度的影响 （mm，±s）

注：130 μg/mL 齐墩果酸为 Q，30 μg/mL 红花黄色素为 H，10 μg/mL 姜黄素为 J，30 μg/mL 紫草素为 Z。

2 d 4 d 6 d 8 d生理盐水 0.24 0.32 0.27 0.25 1.08±0.04 JQHZ 0.24 0.29 0.27 0.26 1.06±0.01 JQZ 0.25 0.32 0.27 0.25 1.09±0.05 JH 0.25 0.31 0.27 0.25 1.08±0.04 QHZ 0.24 0.32 0.28 0.25 1.09±0.20 QZ 0.24 0.29 0.26 0.25 1.04±0.04 JQH 0.25 0.33 0.27 0.26 1.11±0.02 JQ 0.24 0.31 0.27 0.25 1.07±0.04 JZ 0.24 0.28 0.23 0.29 1.04±0.03 QH 0.24 0.31 0.27 0.23 1.07±0.05 HZ 0.23 0.31 0.26 0.25 1.05±0.03组别 小鼠触须毛平均增长长度 小鼠触须最终生长长度

2.5 不同混合组合对小鼠触须毛囊细胞活力的影响 培养8天后，经MTT实验对比，色素混合组均对体外培养的鼠触须毛囊的细胞活力有抑制作用，与阳性对照组和阴性对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。红花黄色素、姜黄素、紫草素混合后不能促进小鼠触须毛囊的生长，且MTT实验示色素混合后对鼠触须毛囊的细胞活力有抑制作用。见表6。

表6 MTT实验混合色素对小鼠触须毛囊细胞活力的影响 （±s）

表6 MTT实验混合色素对小鼠触须毛囊细胞活力的影响 （±s）

注：130μg/mL齐墩果酸为Q，30μg/mL红花黄色素为H，10μg/mL姜黄素为J，30 μg/mL紫草素为Z。★与阴性组比较差异有统计学意义，P<0.05；▲与阳性组比较差异有统计学意义，P<0.05。

images/BZ_24_225_1990_708_2398.png组别 吸光度值（OD）QHZ 0.33±0.10▲★QH 0.30±0.10▲★QZ 0.32±0.13▲★HZ 0.34±0.09▲★齐墩果酸 0.58±0.30生理盐水 0.50±0.07

3 讨论

脱发是以头发数量减少为主要特征的常见疾病。中医角度病因较多，病机复杂，但总属“虚实夹杂，本虚标实”。故治疗以“补虚”为基，结合辨证论治。有中药内服、灸法、针刺、中药涂抹等多种疗法。西医认为脱发主要因局部感染及血液循环灌注异常、体内激素水平代谢紊乱或机体免疫学发病机制异常等引起，治疗主要是针对病因、发病机制的治疗手段。中西医目前对脱发的治疗均有治疗周期长、个体差异大、依从性差等问题，部分西医疗法如5α-还原酶拮抗剂等有较大不良反应。故需探索新的简便易操作、不良反应小、疗效明确的脱发治疗方法。

毛囊的生长有赖于上皮与真皮间的信息传递，从而形成生长期、退行期及休止期的周期循环。近年来，有关毛囊、毛发的研究工作不断进步，探索出鼠触须毛囊、猪毛囊、山羊毛囊、人头皮毛囊等多个游离毛囊的培养模型及相关分离消化方法，并发现了血管内皮细胞生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF）、角质形成细胞生长因子（KGF）-2、细胞外因子（WNT）等多种影响毛囊生长的相关因子[1-4]，成功将毛囊干细胞的培养应用于组织工程学，进行表皮再生等[5-6]。在毛囊的中医药干预研究方面，范卫新等[7]采用中药煎剂进行小鼠的触须毛囊的分离与培养，证实多种单味中药或中药单体有明显的促进毛囊生长的作用，其中包括了女贞子、黄芪、白芷、齐墩果酸等，发现中药单体齐墩果酸浓度为130 μg/mL时促毛囊生长作用达到高峰，与米诺地尔相当。同时通过文献查阅整理分析发现，同一种成分不同浓度，同一味中药采取不同提取方式，同一药物与其本身的提取物，中药的单味与配伍组方使用，对毛囊的生长的影响均有明显差异，甚至会产生促进和抑制2种对立的结果[8-12]。中药红花活血化瘀，通经活络，生姜解表发散行气活血，紫草清热凉血活血散瘀，三者均为中医治疗脱发的重要药物。故本实验从其不同浓度色素有效成分入手，进行毛囊的体外培养，研究不同浓度中药色素对毛囊生长的作用和机制，为治疗脱发寻找新的思路和方法。

实验结果显示3 μg/mL和10 μg/mL的姜黄素、30 μg/mL 的红花黄色素、30 μg/mL 的紫草素均能够有效的促进小鼠毛囊的体外生长，其中10 μg/mL的姜黄素促进作用更为明显。在细胞活力方面，10μg/mL的姜黄素、30 μg/mL 的红花黄色素、30 μg/mL 的紫草素均能够有效促进小鼠毛囊的细胞活力，但30 μg/mL的姜黄素反而对小鼠毛囊的细胞活力起到抑制作用。证明单纯色素可促进毛囊的生长，且与其浓度相关。结合脱发的病理生理因素，以及姜黄素、红花黄色素、紫草素均有抗氧化、改善循环、抗菌的作用，推测中药色素可能是通过清除氧自由基、加速物质的新陈代谢、有害病菌抑制的作用机制促进毛囊、毛发生长，但具体的信号通路及相关细胞因子仍需进一步探索研究。正交实验显示各色素最佳浓度混合，均无促进小鼠毛囊的体外生长的作用，对小鼠毛囊的细胞活力均产生了一定抑制作用。这可能与其均选用最佳浓度，以中药配伍论均属君药，组合浓度不恰当，不符合中医药的君臣佐使配伍有关。因此下一阶段研究需探索单体或更有效的混合浓度比例对毛囊生长的作用机制，并继续建造雄激素性脱发模型、斑秃模型等病理模型以研究中药色素治疗脱发的药理作用。为开发治疗脱发的天然中药制剂提供理论基础。