咽炎片微生物限度检查方法的构建

刘 博 任仲丽 曹鲁娜 李秀菊 张裕民

作者单位：菏泽市食品药品检验检测研究院，山东菏泽 274000

咽炎片主要由玄参、天冬、麦冬、板蓝根、薄荷油等成分组成，具有养阴润肺、清热解毒、清利咽喉、镇咳止痒功效[1]。因处方中的多味药具有抑菌作用[2-8]，根据《中华人民共和国药典》2020年版四部1105 规定，采用增加稀释液或培养基体积、加入适宜的中和剂或灭活剂、采用薄膜过滤法，上述几种方法的联合使用可消除供试品的抑菌活性。为了真实反映药品中微生物污染状况，本研究采用了常规法、增加培养基体积法和薄膜过滤法进行检查，以期建立咽炎片的微生物限度检查方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品根据山东省药品监督管理局药品质量风险监测项目要求，选取10 个不同生产企业的咽炎片样品。

1.1.2 菌种菌种微生物计数方法适用性试验所用菌种为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10104]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]，控制菌检查方法适用性试验所用菌种为大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102]、乙型副伤寒沙门氏菌（Salmonella paratyphi-B）[CMCC(B)50094]，由广东环凯微生物科技有限公司提供，试验所用菌株为第3 代。

1.1.3 仪器电子天平（JY2002，上海精密科学仪器有限公司）、高压蒸汽灭菌器（mLS-3780，三洋）、细菌浊度分析仪（WGZ-2XJ，上海盺瑞仪器仪表有限公司）、生物安全柜（Class Ⅱ BSC，新加坡ESCD 公司）、电热恒温培养箱（DH4000B Ⅱ，天津市泰斯特仪器有限公司）、霉菌培养箱（MJ-250F-1，上海新苗医疗器械制造有限公司）、微生物限度检验仪（HTY-302G，杭州泰林生物技术股份有限公司）。

1.1.4 培养基与试剂胰酪大豆胨液体培养基、pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、麦康凯液体培养基、肠道菌增菌液体培养基、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基等由北京陆桥技术股份有限公司提供。氯化钠、聚山梨酯80 由天津市科密欧化学试剂有限公司提供。

1.2 方法

对10 个不同企业生产的咽炎片进行微生物方法适用性试验。

1.2.1 菌液制备将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门氏菌的新鲜培养物经浊度计比浊后，用0.9%无菌氯化钠溶液10 倍系列稀释制成100～10 000 cfu/ml 的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入10 ml 0.9%无菌氯化钠溶液（含0.05%聚山梨酯80）将孢子洗脱，经浊度计比浊后，稀释制成100～10 000 cfu/ml 的菌悬液，做活菌计数后备用。

1.2.2 供试液的制备 称取供试品10 g，加pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 ml，溶解均匀后得1∶10的供试液。取1∶10 供试液1 ml 加pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液至10 ml，制成1∶100 的供试液，同理制得1∶1 000 的供试液。

1.2.3 需氧菌、霉菌和酵母菌总数计数方法的验证

1.2.3.1 常规法（1 ml/皿）试验组：取5 个灭菌试管装入9.9 ml 1.2.2 项下1∶10 的供试液，每个试管中依次加入金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌悬液0.1 ml；供试品对照组：取相应量的稀释液代替菌液同试验组操作；菌液对照组：取相应量的稀释液替代供试液同试验组操作[9]。以上各组吸取1 ml 注入平皿中，平行制备2 个平皿，倾注15～20 ml 胰酪大豆胨琼脂培养基，置33 ℃培养3 d 计数；分别取白色念珠菌、黑曲霉的实验组、供试品对照组和菌液对照组各1 ml 注入平皿中，平行制备2 个平皿，倾注15～20 ml 沙氏葡萄糖琼脂培养基，置23 ℃培养5 d 计数。

1.2.3.2 增加培养基体积（0.2 ml/皿）试验组：取5 个灭菌试管装入9.9 ml 1.2.2 项下1∶10 的供试液，每个试管中依次加入金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌悬液0.1 ml；供试品对照组：取相应量的稀释液代替菌液同试验组操作；菌液对照组：取相应量的稀释液替代供试液同试验组操作[9]。以上各组吸取2 ml 注入10 个平皿中，倾注15～20 ml 胰酪大豆胨琼脂培养基，置33 ℃培养3 d 计数；分别取白色念珠菌、黑曲霉的实验组、供试品对照组和菌液对照组各2 ml 注入10 个平皿中，倾注15～20 ml 沙氏葡萄糖琼脂培养基，置23 ℃培养5 d 计数。

1.2.3.3 薄膜过滤法试验组：取1.2.2 项下1∶10的供试液1 ml 至100 ml pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液中，用稀释液分3 次冲洗滤膜，100 ml/膜，在末次冲洗中依次加入制备好的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌悬液0.1 ml；供试品对照组：取相应量的稀释液代替菌液同试验组操作；菌液对照组：取相应量的稀释液替代供试液同试验组操作[9]。滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基，平行制备2 个平皿，33 ℃培养3 d 计数；分别取白色念珠菌、黑曲霉的实验组、供试品对照组和菌液对照组各个滤膜，菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基，平行制备2 个平皿，置23 ℃培养5 d 计数。

1.2.4 回收率的计算试验组菌回收率（%）=[（试验组菌落数平均值－供试品对照组菌落数平均值）/菌液对照组菌落平均值]×100%，若3 次平行试验中5 种菌回收率均在70%以上，则认为结果符合验证试验。

1.2.5 控制菌的检查

1.2.5.1 耐胆盐革兰阴性菌取供试品10 g 用胰酪大豆胨液体培养基稀释制成1∶10 供试液，混匀，20～25 ℃培养2 h[9]，依次制成1∶100、1∶1 000的供试液。分别取1∶10、1∶100、1∶1 000 的供试液1 ml 接种至10 ml 肠道菌增菌液体培养基作为供试品组；阳性对照组照供试品组配制，再加入小于100 cfu/ml 的大肠埃希菌和铜绿假单胞菌菌悬液；阴性对照组以稀释液代替供试液，其他同供试品组。放置33 ℃培养箱培养48 h，上述培养物划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，33 ℃培养24 h。

1.2.5.2 大肠埃希菌取1.2.2 项下的1∶10 的供试液10 ml 接种至100 ml 胰酪大豆胨液体培养基作为供试品组；阳性对照组照供试品组配制，再加入小于100 cfu/ml 的大肠埃希菌菌悬液；阴性对照组以稀释液代替供试液，其他同供试品组。置33 ℃培养箱培养24 h，将其1 ml 接种至100 ml 麦康凯液体培养基中，43 ℃培养48 h，之后划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，33 ℃培养72 h[10]。

1.2.5.3 沙门菌取10 g 供试品直接接种于100 ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，置30～35 ℃培养箱中培养18～24 h 作为供试品组；阳性对照组照供试品组配制，再加入小于100 cfu/ml 的乙型副伤寒沙门氏菌菌悬液；阴性对照组以稀释液代替供试品，其他同供试品组。取上述培养物0.1 ml 接种至10 ml RV 沙门菌增菌液体培养基中，置33 ℃培养箱培养24 h，取RV 沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，33 ℃培养48 h[10]。

2 结果

不同企业样品的金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的回收率均低于50%。见表1。增加培养基体积可适当提高金黄色葡萄球菌的回收率，但枯草芽孢杆菌的回收率仍不能达到药典的要求，又选择薄膜过滤法再进行验证。见表2。采用薄膜过滤法各试验菌的回收率均符合要求。见表3。控制菌检查采用常规法，阳性对照均检出生长良好，阴性对照未检出。见表4。

表1 常规法需氧菌、霉菌和酵母菌总数方法平均回收率(%)

表2 增加培养基体积需氧菌、霉菌和酵母菌总数方法平均回收率(%)

表3 薄膜过滤法需氧菌、霉菌和酵母菌总数方法平均回收率(%)

表4 控制菌检查验证结果

3 讨论

药品微生物限度检查指的是微生物对各种中药、西药的侵蚀及感染的程度，并对这种侵蚀程度进行实验验证，在规定的试验条件下，检查样品中存在微生物的数量以及是否存在特定微生物[10]。在检验过程中易受到各种因素的影响，不仅要遵循药品检验的相关标准，还要符合微生物的检测要求，除了要牢记“无菌、快速、准确”外还要谨记微生物的特殊性[11]。以最大程度保证微生物检测结果的准确性，降低误差率。

咽炎片处方中含有多种抑菌成分，具有抑菌作用的成分可影响微生物限度检查的准确性[12]。虽然不同企业同名中药制剂的成分基本相同，但其含量存在一定差异[13]，同一种中草药由于不同来源、季节性变化、植物不同部位、不同提取方法导致其成分也有差别[4]。为了保证检查方法的可靠性，本研究通过对10 个不同企业生产的50 批次的咽炎片样品进行了需氧菌、霉菌和酵母菌总数及控制菌的方法验证。结果表明金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌采用常规法和增加培养基体积法不能完全消除供试品的抑菌活性，说明咽炎片对需氧菌有较强的抑菌作用，应重新选择适当的方法进行验证。含有抑菌成分的中成药往往对这两种菌有作用，这与相关研究一致[14-15]。为进一步验证方法适用性结果的可行性，本研究选取了薄膜过滤法进行再验证，结果表明，采用薄膜过滤法各种菌的回收率在70%以上，因此选择薄膜过滤法（300 ml/膜）对咽炎片进行微生物计数检查，符合方法适用性试验要求。咽炎片的控制菌检查方法有效性验证试验表明，10 个企业生产的50 批次的咽炎片均可使用常规法进行检查。结果完全符合《中华人民共和国药典》2020年版四部微生物限度检查控制菌验证要求，所以该方法可行。本试验建立的方法准确、可靠，适用于咽炎片的微生物限度检查。