加味三核颗粒质量控制研究*

李慧峰 孟 霜 冯振宇 周晓荣 王鑫鑫 裴妙荣※ 赵建平

（1.山西中医药大学中药与食品工程学院，山西 晋中 030619；2.山西省中西医结合医院中心实验室，山西 太原 030013；3.山西中医药大学研究生学院，山西 晋中 030619）

前列腺增生症是引发中老年男性排尿障碍的一种常见良性疾病，在50 岁人群中发病率为40%，在80 岁以上人群中发病率接近90%，90 岁以后人群发病率几乎100%。我们目前逐步进入人口老龄化阶段，前列腺增生症患者逐年增加，严重影响老年人的生活质量，甚至还可能伤及肾脏，造成肾功能不全等后果[1]。加味三核颗粒是国医大师王世民教授由经典古方加味而成，由橘核、山楂核、荔枝核、黄柏、水红花子等多味中药组成的中药制剂，治疗前列腺增生疗效显著，极大地减轻了患者的病痛。本论文就加味三核颗粒的薄层定性鉴别、含量测定、方法学考察进行研究，建立加味三核颗粒的完整、全面的质量控制方法，为加味三核颗粒的质量控制研究奠定一定的基础。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 美国Waters e2695 高效液相色谱仪，Waters 2998 紫外检测器，Empower 工作站；CAMAG TLC VISUALIZER 薄层成像仪；CAMAG LINOMAT 5 半自动点样仪；瑞士METTLERA B135-S 电子天平；SB-800 DTD超声波清洗机。

1.2 试剂 乙腈、磷酸为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯；盐酸小檗碱对照品（批号：110713-201915）；黄柏对照药材（批号：121510-201807）；补骨脂对照药材（批号：121056-201605）；蛇床子对照药材（批号：121030-201808），以上标准品均购自中国食品药品检定研究院。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 黄柏的薄层鉴别 将样品研磨成细粉状，取3 g 于具塞锥形瓶中，加入20 mL 分析纯甲醇，超声波清洗机超声30 min 后过滤取出，在水浴锅上蒸干得到的滤液，加3 mL 分析纯甲醇溶解残渣后得到的溶液即为供试品溶液。另取黄柏对照药材2.0 g，制备方法同供试品溶液，作为对照药材溶液。再取黄柏阴性样品3 g，制备方法同供试品溶液，即得缺黄柏的阴性对照溶液[2，3]。参照2020 版《中华人民共和国药典》四部0502 通则[4]下薄层色谱法，将制备好的3 个批次供试品、黄柏对照药材以及缺少黄柏的阴性对照溶液各吸取1 μ L，应用薄层色谱点样仪，分别点于同一硅胶G 薄层板上，点好的薄层板在内含乙酸乙酯-甲酸-水（8∶1∶1）为展开剂的展开槽中展开完全后，将薄层板从展开槽中取出，通风处晾干，在紫外光灯（366 nm）下观察，结果发现3 个批次供试品薄层色谱图与黄柏对照药材薄层色谱图在同一位置上有相同颜色的荧光斑点显现，图谱显色清晰，阴性对照未见干扰。结果见图1。

图1 黄柏薄层色谱图

2.1.2 补骨脂的薄层鉴别 将样品研磨成细粉状，取2 g于具塞锥形瓶中，加入20 mL 分析纯甲醇，超声波清洗机超声45 min 后过滤取出，在水浴锅上蒸干得到的滤液，加3 mL 分析纯甲醇溶解残渣后得到的溶液即为供试品溶液。另取0.5 g 补骨脂对照药材、2 g 补骨脂阴性样品分别制备对照药材和缺补骨脂的阴性对照溶液，方法同上[3，5]。参照2020 版《中华人民共和国药典》四部0502 通则[4]下薄层色谱法，将制备好的3 个批次供试品、补骨脂对照药材以及缺少补骨脂的阴性对照溶液各吸取2 μ L，应用薄层色谱点样仪分别点置于同一个硅胶G 板上，点好的薄层板在内含乙酸乙酯-正己烷（3∶1）展开剂的展开槽中展开完全后，将薄层板从展开槽中取出，通风处晾干，以10%氢氧化钾甲醇溶液作为显色剂，将其均匀的喷洒于展好的薄层板上，105 ℃ 恒温处理，结果发现3 个批次供试品色谱图与补骨脂对照药材色谱图在同一位置上有相同颜色的斑点显现，图谱显色清晰，阴性对照未见干扰。结果见图2。

图2 补骨脂薄层色谱图

2.1.3 蛇床子的薄层鉴别 将样品研磨成细粉状，取2 g 于具塞锥形瓶中，加入20 mL 分析纯甲醇，超声波清洗机超声40 min 后过滤取出，在水浴锅上蒸干得到的滤液，加3 mL 分析纯甲醇溶解残渣后得到的溶液即为供试品溶液。另取2 g 蛇床子对照药材、2 g 蛇床子阴性样品分别制备对照药材和缺蛇床子的阴性对照溶液，方法同上[3，5]。参照2020 版《中华人民共和国药典》四部0502 通则[4]下薄层色谱法，将制备好的3 个批次供试品、蛇床子对照药材以及缺蛇床子的阴性对照溶液各吸取2 μ L，应用薄层色谱点样仪分别点置于同一硅胶G 薄层板上，点好的薄层板在内含二氯甲烷-乙酸乙酯-正己烷（2∶3∶2）展开剂的展开槽中展开完全后，将薄层板从展开槽中取出，避光处晾干，在紫外光灯（366 nm）下观察，结果发现3 个批次供试品色谱图与蛇床子对照药材色谱图在同一位置上有相同颜色的荧光斑点显现，图谱显色清晰，阴性对照未见干扰。结果见图3。

图3 蛇床子薄层色谱图

2.1.4 水红花子的薄层鉴别 将样品研磨成细粉状，取3 g 于具塞锥形瓶中，加入20 mL 分析纯甲醇，超声波清洗机超声30 min 后过滤取出，在水浴锅上蒸干得到的滤液，加20 mL 蒸馏水溶解残渣后得到的溶液用20 mL 的乙酸乙酯萃取2 次，合并并浓缩乙酸乙酯液，水浴蒸干萃取液，加1 mL 分析纯甲醇溶解残渣后得到的溶液即为供试品溶液。另取1 g 水红花子对照药材、3 g水红花子阴性样品分别制备对照药材和缺水红花子的阴性对照溶液，方法同上[3，6]。参照2020 版《中华人民共和国药典》四部0502 通则[4]下薄层色谱法，将制备好的3个批次供试品、水红花子对照药材以及缺水红花子的阴性对照溶液各吸取5 μ L，点于同一张聚酰胺薄膜上，点好的薄膜置于含氯仿-甲醇（3∶2）展开剂的展开槽中展开完全后，将薄膜从展开槽中取出，通风处晾干，将10%三氯化铝乙醇溶液均匀喷在薄膜上，在紫外光灯（366 nm）下观察，结果发现3 个批次供试品色谱图与水红花子对照药材色谱图在同一位置上有相同颜色的荧光斑点显现，图谱显色清晰，阴性对照未见干扰。结果见图4。

图4 水红花子薄层色谱图

2.2 含量测定[7，8]

2.2.1 色谱条件 固定相：Gemini C18柱（4.6 mm× 250 mm，5 μ m）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50）（每1000 mL 加十二烷基苯磺酸钠0.1 g）；流速：1 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：265 nm。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成每1 mL 含0.32 mg 的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取装量差异项下的本品，研细，取约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性样品溶液的制备 按处方比例分别称取除黄柏以外的其余药味，按照加味三核颗粒的制备工艺制成阴性样品，按2.2.3 项下供试品溶液的制备方法制作，制备成阴性样品溶液。

2.2.5 专属性实验 分别精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液，供试品溶液及阴性样品溶液各10 μ L，按2.2.1 项下所述的色谱条件进行测定。结果表明：阴性样品溶液在盐酸小檗碱的色谱峰位置上无吸收，表明该方法的专属性良好。结果见图5。

图5 加味三核颗粒HPLC 色谱图

2.2.6 线性关系考察 精密称取盐酸小檗碱对照品6.40mg，置10 mL 棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀；再分别精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.6、2 mL 至2 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得不同浓度对照品溶液，分别进样10 μ L，测定峰面积积分值，以峰面积积分值为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X，ng）作图，得一直线回归方程：Y＝2883.1X+44363，R2＝0.9996，r＝0.9998，故盐酸小檗碱进样量在640～6400 ng 进样范围内，浓度与色谱峰峰面积呈良好线性。

2.2.7 精密度实验 精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液（0.32 mg/mL）10 μ L，连续进样6 次，测定盐酸小檗碱峰面积积分值，其RSD 为0.60%（n=6）。结果表明：该高效液相色谱仪的精密度良好。

2.2.8 稳定性实验 取供试品溶液（批号20200820）在0、2、4、6、8、10、12 h 分别进样10 μ L，测定样品中盐酸小檗碱峰面积积分值，其RSD 为0.97%。结果表明：供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

2.2.9 重复性实验 精密称取同一批号（批号20200820）的加味三核颗粒6 份，按3 项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，精密吸取10 μ L，进样，测定峰面积积分值并计算含量。结果样品中盐酸小檗碱的平均质量分数为3.9977 mg/g，RSD＝1.06%。结果表明该方法重复性良好。

2.2.10 回收率实验 精密称取已知含量批次样品（批号20200820，3.9977 mg/g）6 份，分别精密添加盐酸小檗碱对照品适量，按“供试品溶液制备”项下的方法制备供试品溶液，测定峰面积积分值，计算回收率。结果盐酸小檗碱的平均回收率为100.56%，RSD 为1.46%，表明该方法测定结果的准确度较高。结果见表1。

表1 加样回收率实验测定结果

2.2.11 样品含量测定 取3 批样品，按供试品溶液制备方法制备，依法测定，计算样品中盐酸小檗碱的含量。结果见表2。

表2 样品中盐酸小檗碱含量测定结果

3 讨论

本文采用TLC 法对加味三核颗粒中黄柏、补骨脂、蛇床子、水红花子进行定性鉴别，结果供试品样品与对照药材相对应的位置有相同颜色的斑点，斑点清晰，阴性对照无干扰，实验专属性强，可以作为加味三核颗粒的定性鉴别方法。

黄柏是加味三核颗粒的君药，其中盐酸小檗碱为黄柏的主要药效成分，故选择盐酸小檗碱作为控制本品质量的指标性成分。实验参照《中华人民共和国药典》一部、四部及文献报道，采用HPLC 法对盐酸小檗碱进行含量测定。为获得最佳的分离效果，依据参考文献进行条件摸索，最终选择检测波长为265 nm[8]，流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（50∶50）（每1 L 流动相中加十二烷基苯磺酸钠0.1 g）[4，9]。流动相在配置的过程中先配置乙腈-0.1%磷酸溶液，再加十二烷基苯磺酸钠，这样操作可以避免大量气泡的产生。本方法简便，容易操作，结果准确，可用于加味三核颗粒的质量控制。