紫苏叶多糖对酒精性肝损伤小鼠的保护作用

陶豫东,田会君,李 云,罗晓英

1.河南省人民医院/郑州大学人民医院急诊科,郑州 450000;2.河南省人民医院/郑州大学人民医院消化科,郑州450000

中药紫苏叶具有发表散寒、理气和营的功效,所含的多糖和黄酮类成分为其主要活性成分[1-3]。紫苏叶多糖及紫苏总黄酮具有较好的抗糖尿病作用,能够降低糖尿病模型小鼠的血糖,改善其血脂水平,同时可通过抑制氧化应激和抗炎改善2型糖尿病大鼠的肝脏损伤[4]。沉默信息调节因子蛋白1（silent information regulator factor 2 related enzyme 1,SIRT1）可激活腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK）信号通路,调节脂肪生成和肝脏脂质沉积,参与酒精性肝病的进程[5]。因此,本文主要研究紫苏叶多糖对酒精性肝损伤（alcoholic liver disease,ALD）小鼠是否具有改善作用,并明确该作用是否与抗炎及SIRT1-AMPK 信号通路具有关联性,初步阐明其具体的作用及机制,为其临床应用奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

AU2700型全自动生物化学分析仪（日本奥林巴斯有限公司）;SW1022-ProfiBlot 48型全自动蛋白印迹分析仪（美国Bioneer公司）;IX73型倒置荧光显微镜（日本奥林巴斯有限公司）。

1.2 试药

紫苏叶多糖由紫苏叶药材经水提醇沉法、脱色、脱蛋白等步骤纯化[4],用苯酚-硫酸法检测紫苏叶多糖的质量分数为75%。

白细胞介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）、白细胞介 素-6（interleukin-6,IL-6）及肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）检测试剂盒均购自伊艾博（武汉）科技股份有限公司;丙二醛（malondialdehyde,MDA）、超氧化物歧化酶（super compound dismutase,SOD）及谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;SIRT1、AMPKα、p-AMPKα、SREBP-1c一抗及GAPDH 抗体均购自美国Abbiotec公司。

1.3 动物

SPF级雄性C57BL/6J小鼠40只,8～10周龄,体质量18～25 g,动物合格证号202010208,动物许可证号SCXK（京）2020-2-006,动物批次号202010108,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

2 方法

2.1 ALD 小鼠模型的建立和分组

40只雄性C57BL/6J小鼠适应性喂养1周后,随机分为4组:空白对照组、ALD 模型组、紫苏叶多糖低剂量组、紫苏叶多糖高剂量组,每组10只,全部操作经实验动物管理委员会批准。除空白对照组外,其余3 组均采用慢性乙醇灌胃法诱导ALD 小鼠模型[6]:ALD 模型组小鼠连续处理60 d,每日用体积分数为50%的乙醇（12 mL·kg-1·d-1）灌胃;紫苏叶多糖低、高剂量组在经体积分数为50%的乙醇（12 mL·kg-1·d-1）灌胃2 h 后再分别用0.3、0.6 g·kg-1的紫苏叶多糖灌胃;空白对照组则用等量的生理盐水灌胃。在第61天处死以上各组小鼠,断头收集血清,分离肝脏左叶并浸泡于体积分数为10%的中性福尔马林中,其余部分冻存于-80℃冰箱内,用于后续实验。

2.2 ALD 小鼠肝脏组织HE染色及油红O 染色

按照参考文献[7]中的方法进行HE 染色:用体积分数为4%甲醛溶液固定24 h,用二甲苯透明,用石蜡包埋,用苏木素精及伊红染色,用光学显微镜观察肝脏组织病理学改变,并进行图像采集。

按照参考文献[8]中的方法进行油红O 染色:将取得的肝脏左叶组织进行横切取材,制做油红O 冰冻染色切片,在正置显微镜下观察肝脏细胞脂肪变性情况并摄片,其中肝脏细胞中的脂肪小滴呈红色、细胞核呈蓝色、细胞间质无色,依据视野中脂滴的分布及所占视野的面积比例进行综合评分。评分标准为:0分,染色脂滴稀少并呈散在分布;1分,染色脂滴占视野面积≤1/4;2分,1/4＜染色脂滴占视野面积≤1/2;3分:1/2＜染色脂滴占视野面积≤3/4;4分,3/4＜染色脂滴占视野面积≤1。

2.3 血清生化指标检测

各组小鼠处死前收集血清,于4℃静置20 min后,在4℃以2 000 r·min-1离心20 min,随后吸取上清,分装后保存于-80℃待测。用全自动生化分析仪检测血清中丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase,AST）、三酰甘油（total cholesterol,TG）、总胆固醇（total cholesterol,TC）及低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol,LDL）和高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol,HDL）的含量[9]。

2.4 ALD 小鼠肝脏组织炎性因子检测

分离上述各组小鼠肝脏组织,参考文献[10]中的方法制备肝脏匀浆（在匀浆器中,按照肝脏质量/体积为1∶9加入预冷生理盐水,制备成肝脏组织匀浆）,在4℃以3 500 r·min-1离心20 min,随后吸取上清,严格按照ELISA 试剂盒说明书操作,每孔中加入10μL样品及40μL 样本稀释液,用酶标仪检测450 nm处的吸光度并按照标准曲线计算样品中IL-1β、TNF-α、IL-6的水平。

2.5 ALD 小鼠肝脏组织氧化应激因子水平检测

按照2.4项下的方法制备肝脏组织匀浆,并吸取组织上清液,按照试剂盒的说明书检测肝脏组织中MDA、SOD 及GSH-Px的含量[11]。

2.6 ALD 小鼠肝脏组织SIRT1-AMPK 信号通路蛋白的测定

分离上述各组小鼠的肝脏组织,按照参考文献[12]中的方法制备肝组织匀浆,使用RIPA 裂解液（RIPA Lysis Buffer）裂解后提取肝脏总蛋白,应用BCA 试剂盒进行蛋白定量,95℃水浴5 min,蛋白变性后用SDSPAGE胶进行电泳,湿法转膜,置于脱脂牛奶中室温封闭1 h后,依次加入用封闭液稀释的兔源单克隆AMPKα（1∶1 000）、p-AMPKα（1∶1 000）、SREBP1c（1∶500）、GAPDH（1∶1 000）和SIRT1（1∶1 000）一抗,辣根过氧化物酶标记的兔抗二抗（1∶2 000）,用化学底物发光法显色,图像扫描分析,采用Image-QuaNT 软件检测其吸光度,以各GAPDH 为内参进行分析。

2.7 统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行统计分析,计量资料用均数±标准差（）表示,多组间均数比较采用one-way ANOVA 检验,两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 紫苏叶多糖对ALD小鼠肝脏组织病理学的影响

各组小鼠肝脏组织病理学结果如图1所示,空白对照组小鼠肝组织结构清晰完整,未见炎性细胞浸润,可见稀少脂滴存在;ALD 模型组小鼠肝组织结构形态不完整,如图1中红色箭头所示,细胞质分界不清,细胞核碎裂明显,嗜酸性明显增强,可见较多的肝细胞脂肪变性,如图1中黑色箭头所示,可见较多大小不一的脂肪空泡,如图1中黄色箭头所示,ALD 模型组小鼠的肝组织还存在轻度出血,如图1中绿色箭头所示,肝细胞内广泛存在炎性细胞浸润;紫苏叶多糖低、高剂量组小鼠肝细胞损伤情况较ALD 模型组明显改善,结构比较完整,未见明显炎性细胞浸润和出血,但可见肝细胞内存在脂肪变性,但较ALD 模型组明显减轻。

图1 各组小鼠肝脏组织HE染色结果 （×200）Fig.1 HE staining of liver tissue of mice in each group （×200）

3.2 紫苏叶多糖对ALD 小鼠肝脏组织脂肪变性的影响

各组小鼠肝脏组织油红O 染色结果如图2 所示,ALD 模型组小鼠肝脏脂滴的数量较空白对照组明显增多,紫苏叶多糖低、高剂量组肝脏脂质沉积情况得以明显改善。

图2 各组小鼠肝脏油红O 染色结果 （×200）Fig.2 Oil Red O staining of liver in each group of mice（×200）

各组小鼠肝脏组织脂肪变性情况比较见表1。由表1可见,与空白对照组比较,ALD 模型组小鼠肝脏脂肪细胞变性评分明显升高（P＜0.05）;与ALD 模型组比较,紫苏叶多糖低、高剂量组小鼠肝脏脂肪细胞变性评分显著降低（P＜0.05）。

表1 各组小鼠肝脏组织脂肪变性情况比较 （,n=10）Tab.1 Comparison of the fatty degeneration of the liver tissues of mice among groups （,n=10）

表1 各组小鼠肝脏组织脂肪变性情况比较 （,n=10）Tab.1 Comparison of the fatty degeneration of the liver tissues of mice among groups （,n=10）

注:与空白对照组比较,a P ＜0.05;与ALD 模型组比较,b P＜0.05;与紫苏叶多糖低剂量组比较,c P＜0.05。

3.3 紫苏叶多糖对ALD 小鼠血清生化指标的影响

各组小鼠血清生化指标的检测结果见表2。与空白对照组比较,ALD 模型组小鼠血清中ALT、AST、TG、TC、LDL的水平均显著升高（P＜0.05）,HDL的水平显著降低（P＜0.05）。与ALD 模型组比较,紫苏叶多糖低、高剂量组ALT、AST、TG、TC、LDL的水平均显著降低（P＜0.05）,HDL 的水平显著上升（P＜0.05）。紫苏叶多糖低、高剂量组相比,上述指标的差异同样具有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组小鼠血清生化指标的比较 （,n=10）Tab.2 Comparison of serum biochemical indexes of mice among groups （,n=10）

表2 各组小鼠血清生化指标的比较 （,n=10）Tab.2 Comparison of serum biochemical indexes of mice among groups （,n=10）

注:与空白对照组比较,a P＜0.05,aa P＜0.01;与ALD 模型组比较,b P＜0.05;与紫苏叶多糖低剂量组比较,c P＜0.05。

3.4 紫苏叶多糖对ALD小鼠肝组织炎性因子的影响

各组小鼠肝组织中炎症因子水平的检测结果见表3。与空白对照组比较,ALD模型组小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α的水平均显著升高（P＜0.05）。与ALD模型组比较,紫苏叶多糖低、高剂量组IL-1β、IL-6、TNF-α的水平均显著降低（P＜0.05）。紫苏叶多糖低、高剂量组间上述指标的差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表3 各组小鼠肝组织中炎症因子水平的比较（,n=10）Tab.3 Comparison of the levels of inflammatory factors in the liver tissues of mice among groups（,n=10）

表3 各组小鼠肝组织中炎症因子水平的比较（,n=10）Tab.3 Comparison of the levels of inflammatory factors in the liver tissues of mice among groups（,n=10）

注:与空白对照组比较,a P＜0.05,aa P＜0.01;与ALD模型组比较,b P＜0.05,bb P＜0.01;与紫苏叶多糖低剂量组比较,c P＜0.05。

3.5 紫苏叶多糖对ALD 小鼠肝组织氧化应激因子水平的影响

各组小鼠肝组织中氧化应激因子水平的检测结果见表4。与空白对照组比较,ALD 模型组小鼠肝组织中MDA 的含量显著升高（P＜0.01）,SOD 和GSH-Px的含量均显著降低（P＜0.01）。与ALD 模型组比较,紫苏叶多糖低、高剂量组MDA 的含量显著降低（P＜0.01）,SOD 和GSH-Px的含量均显著升高（P＜0.01）。紫苏叶多糖低、高剂量组间上述指标的差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表4 各组小鼠肝组织中氧化应激因子水平的比较 （,n=10）Tab.4 Comparison of the levels of oxidative stress factors in the liver tissues of mice among groups（,n=10）

表4 各组小鼠肝组织中氧化应激因子水平的比较 （,n=10）Tab.4 Comparison of the levels of oxidative stress factors in the liver tissues of mice among groups（,n=10）

注:与空白对照组比较,a P＜0.05,aa P＜0.01;与ALD模型组比较,b P＜0.05,bb P＜0.01;与紫苏叶多糖低剂量组比较,c P＜0.05。

3.6 紫苏叶多糖对ALD 小鼠肝组织中SIRT1、AMPKα、p-AMPKα、SREBP1c蛋白表达量的影响

各组小鼠肝组织中各蛋白的表达量见图3。与空白对照组比较,ALD 模型组小鼠肝组织中SREBP1c的相对表达量显著升高（P＜0.05）,SIRT1和p-AMPKα/AMPKα的相对表达量均显著降低（P＜0.05）。与ALD 模型组比较,紫苏叶多糖低、高剂量组SREBP1c的相对表达量显著降低（P＜0.05）,SIRT1和p-AMPKα/AMPKα的相对表达量均显著升高（P＜0.05）,SREBP1c 和p-AMPKα/AMPKα的相对表达量在紫苏叶多糖低、高剂量组间的差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图3 各组小鼠肝组织中SIRT1、AMPKα、p-AMPKα 和SREBP1c蛋白表达量的检测结果Fig.3 Graphical representation of SIRT1,AMPKα,p-AMPKαand SREBP1c protein expression in liver tissues of mice in each group

4 讨论

紫苏作为药食同源的中草药,具有抗菌消炎和抗氧化作用,其多种活性成分被应用于心血管疾病及增加免疫力药物的研发[13]。紫苏叶多糖作为其主要多糖类活性成分能加快机体清除疲劳代谢物的速度,延缓疲劳的发生。紫苏叶多糖具有较好的抗糖尿病作用,在降低血糖的同时可通过抑制氧化应激、抗炎等发挥改善2型糖尿病大鼠肝损伤和调节糖尿病模型小鼠血脂代谢紊乱的作用[14]。在应用紫苏叶多糖后,可明显降低糖尿病模型小鼠血清中ALT、AST、TC、TG、LDL-C 的水平。在本研究中,紫苏叶多糖能明显改善ALD 模型组小鼠的肝组织炎性细胞浸润、出血和脂肪变性,降低肝脏脂肪细胞评分,血清中ALT、AST、TG、TC、LDL 的含量均显著降低,HDL水平显著升高,说明紫苏叶多糖对缓解酒精诱导的肝损伤、脂肪变性及血脂代谢紊乱同样具有较好的疗效。

氧化应激和炎症反应在ALD 及并发症的进展中具有重要作用[15]。长期饮酒导致肝脏氧化应激水平明显升高,其终产物MDA 大量形成而耗竭体内的SOD、GSH-Px等抗氧化物酶,过多的自由基产物致使肝脏的炎性物质大量释放,进而促进肝炎、肝硬化乃至肝癌的发生[16-17],因此,对于ALD,保肝、抗炎、抗氧化是治疗的关键。在本研究中,紫苏叶多糖明显降低ALD模型组小鼠肝组织中IL-1β、IL-6、TNF-α及MDA的含量,而SOD和GSH-Px的含量明显上升,表明紫苏叶多糖能提高ALD模型组小鼠肝脏的抗氧化活性,减少氧化应激产物和炎性物质的生成量,提示其改善ALD模型小鼠肝损伤和血脂代谢紊乱的作用与抑制氧化应激及炎症反应有关。

SIRT1可由肝脏表达,参与糖脂代谢和炎性反应的调节,SIRT1 可调控下游分子AMPK,参与抗炎、抗氧化应激等多种生物学过程,肝脏的AMPK 可通过磷酸化作用激活其下游蛋白激酶SREBP-1c分子,参与肝脏的脂质合成与代谢[18-19]。研究显示,肝内SIRT1的过表达可有效抑制因酒精引起的脂质代谢紊乱[20]。在本研究中,ALD 小鼠肝组织中SIRT1的表达量及AMPKα的磷酸化水平均显著降低,SREBP1c的相对表达量明显升高,表明在ALD 小鼠体内SIRT1-AMPK 信号通路受到抑制;在经紫苏叶多糖干预后,SIRT1 和p-AMPKα/AMPKα的相对表达量均显著上升,SREBP1c的相对表达量显著降低,表明紫苏叶多糖可能通过激活SIRT1-AMPK 通路,减轻体内氧化应激和炎症反应,调节脂质合成与代谢的关键调控分子,抑制脂肪酸合成,从而在缓解ALD 中发挥作用。

综上所述,紫苏叶多糖能改善ALD 模型小鼠因酒精引起的脂肪变性损伤和炎症水平,对肝脏具有一定的保护作用,其机制可能与活化SIRT1/AMPK 信号通路有关。