盐酸氨基葡萄糖颗粒的含量测定方法研究

但晓梦,谢育媛,郭江红,姜 红

湖北省药品监督检验研究院,国家药品监督管理局血液制品质量控制重点实验室,武汉 430073

盐酸氨基葡萄糖是人体关节软骨基质合成蛋白聚糖必需的重要成分,主要用于预防和治疗各种类型的骨性关节炎,如膝关节、髋关节、脊柱、肩、手腕和踝关节等部位以及全身性的骨性关节炎[1-3]。氨基葡萄糖是软骨基质和滑液中合成氨基葡聚糖和蛋白聚糖的组分和首选底物。氨基葡萄糖可刺激软骨细胞产生具有正常多聚体结构的糖蛋白,抑制损害关节软骨的酶（如胶原酶和磷脂酶A2等）的活性,抑制损伤细胞的超氧化物自由基的产生,从而减少损伤细胞内毒素因子的释放。又因其属于生物提取物质,故安全性较高,不良反应极少,因而被广泛用于医药及保健食品领域,用于治疗全身各种骨性关节炎[4-6]。

随着人们对身体健康重视程度的逐年提高,盐酸氨基葡萄糖类药物应用于治疗骨性关节炎的使用量也随之显著增长。近年来,盐酸氨基葡萄糖类药物上市剂型由经典的胶囊剂、普通片剂衍生出了更多的剂型,如颗粒剂、散剂、泡腾片剂,提示该类药物的市场需求量较大[7-8]。

通过检索国家食品药品监督管理局网站上的基础数据库可知,盐酸氨基葡萄糖颗粒在国内有2家生产企业,分别为企业A（企业注册标准YBH02202009）和企业B（企业注册标准YBH00352014）。企业A 生产的盐酸氨基葡萄糖颗粒的辅料为蔗糖、聚维酮K30,企业B的辅料为蔗糖、聚维酮K30、乳糖等。现阶段氨基葡萄糖类药物国家质量标准尚未统一[9-13],相关生产企业仅凭各自的企业注册标准对氨基葡萄糖类药物进行检测,而其中含量测定等关键项目质量控制方法差异较大且并不适用于盐酸氨基葡萄糖颗粒剂的检测,主要原因在于盐酸氨基葡萄糖颗粒剂的辅料中包含蔗糖、乳糖等物质,均为小分子糖类,在企业注册标准中含量测定色谱条件下较难分离,故不能有效控制产品含量[14-16]。因此,亟待对盐酸氨基葡萄糖颗粒标准进行深入研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695 Alliance高效液相色谱仪,包括柱温箱、在线真空脱气机、2489 紫外检测器以及Empower色谱工作站（美国Waters公司）;XP205电子天平（梅特勒-托利多公司）。

1.2 试药

盐酸氨基葡萄糖颗粒（企业A,批号12A170303、12A 170304;企业B,批号190202、190204、190205）。

盐酸氨基葡萄糖对照品（批号140649-201606,质量分数100%,中国食品药品检定研究院）;盐酸氨基葡萄糖原料药（批号1803-2018-H020,浙江诚意药业有限公司）;蔗糖（批号20190409,嘉兴市白浪淀粉制品有限公司）;聚维酮K30（批号200816,安徽山河药用辅料有限公司）;乳糖（批号200801,企业A）;氯化钠、磷酸氢二钾、氨水、磷酸（分析纯,国药集团化学试剂有限公司）;乙腈（色谱纯,美国Tedia天地试剂公司）;水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:CAPCELL PAK NH2柱（150 mm×4.6 mm,5μm）;流动相:磷酸盐溶液（取磷酸氢二钾3.5 g,加水1 000 mL使溶解,加入0.25 mL氨水,用磷酸调pH 值至7.5）-乙腈（25∶75）;流速:1.5 mL·min-1;进样量:20μL;柱温:30℃;检测波长:195 nm。

2.2 溶液的制备

2.2.1 空白辅料定位溶液 蔗糖溶液:精密称取蔗糖213.0 mg,置于10 mL 量瓶中,加水使其溶解并稀释至刻度,摇匀,过滤,取续滤液稀释至质量浓度为10 mg·mL-1,即得。

聚维酮K30溶液:精密称取聚维酮K30 205.1 mg,置于10 mL量瓶中,加水使其溶解并稀释至刻度,摇匀,过滤,即得。

乳糖溶液:精密称取乳糖112.5 mg,置于10 mL量瓶中,加水使其溶解并稀释至刻度,摇匀,过滤,即得。

2.2.2 氯离子（Cl-）溶液 精密称取12.8 mg氯化钠置于10 mL量瓶中,加水使其溶解并稀释至刻度,摇匀,作为Cl-定位溶液。

2.2.3 供试品溶液 精密称取盐酸氨基葡萄糖颗粒粉末（相当于氨基葡萄糖约200 mg）,置于50 mL 量瓶中,加水使其溶解并稀释至刻度,摇匀,过滤,取续滤液作为供试品溶液。

2.2.4 对照品溶液 精密称取盐酸氨基葡萄糖对照品,加水使其溶解并定量稀释制成每1 mL中约含盐酸氨基葡萄糖4.0 mg的溶液。

2.3 专属性实验

精密量取2.2.1～2.2.4项下的溶液各20μL,按照2.1项下色谱条件测定,记录色谱图。在上述色谱条件下,盐酸氨基葡萄糖颗粒剂中成盐离子氯离子（Rt=2.30 min）、辅料蔗糖（Rt=11.14 min）、乳糖（Rt=15.96 min,倒峰）及聚维酮K30（Rt=1.26 min）对氨基葡萄糖（Rt=13.05 min）的测定均无干扰。结果见图1。

图1 盐酸氨基葡萄糖颗粒含量测定系统适用性HPLC图Fig.1 HPLC chromatograms of system suitability test of the content determination method of Glucosamine Hydrochloride Granules

2.4 线性关系考察

精密称取盐酸氨基葡萄糖对照品146.64 mg,置于10 mL量瓶中,加水使其溶解并稀释至刻度,摇匀,配制成含盐酸氨基葡萄糖质量浓度为14.6 mg·mL-1的溶液,作为储备液。分别量取储备液适量,用水稀释制成1 mL含盐酸氨基葡萄糖1.46、3.66、5.86、7.33、8.79、10.99 mg的溶液,分别吸取上述溶液各20μL注入液相色谱仪,记录色谱图。以峰面积为纵坐标（y）、质量浓度为横坐标（x）进行线性回归。结果表明,盐酸氨基葡萄糖质量浓度在1.46～10.99 mg·mL-1范围内时,与峰面积呈良好的线性关系。回归方程为y=277 074x-12 990,R=0.999 1。

2.5 检测限与定量限实验

精密称取盐酸氨基葡萄糖对照品17.63 mg,置于5 mL量瓶中,加水使其溶解并稀释至刻度,摇匀;再精密量取上述溶液1 mL,置于25 mL 量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,在HPLC色谱仪检测器稳定操作的条件下进样8μL,所得信噪比（S/N）为13.2,即定量限为1.1μg。在高效液相色谱仪检测器稳定操作的条件下进样上述溶液3μL,所得信噪比（S/N）为3.1,即定量限为0.4μg。

2.6 精密度实验

取盐酸氨基葡萄糖颗粒适量,用水配制成质量浓度约为4 mg·mL-1的盐酸氨基葡萄糖溶液,重复进样测定6 次,记录其峰面积。计算得RSD 值为0.2%,表明该方法的精密度良好。

2.7 加样回收率实验

取盐酸氨基葡萄糖颗粒（企业B,批号190205）2.635 6 g,加水300 mL使其溶解并稀释至刻度（盐酸氨基葡萄糖的质量浓度为2.0 mg·mL-1）,摇匀,作为盐酸氨基葡萄糖颗粒回收率本底溶液。用于精密配制含盐酸氨基葡萄糖对照品（质量浓度4 mg·mL-1）80%、100%、120%3种不同的9份模拟样品,扣除回收率本底溶液后已知药物的质量浓度分别约为3.2、4.0、4.8 mg·mL-1,作为加样回收率供试品溶液。按照拟定的含量测定方法测定;另取盐酸氨基葡萄糖对照品104.2 mg,置于25 mL 量瓶中,加水使其溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液。根据盐酸氨基葡萄糖加入量与测得量计算回收率,计算得平均回收率为100.6%,RSD 值为0.5%。结果见表1。

表1 盐酸氨基葡萄糖颗粒的回收率实验结果Tab.1 Results of recovery test of Glucosamine Hydrochloride Granules

2.8 重复性实验

按照2.2.3项下方法,称取盐酸氨基葡萄糖颗粒样品（企业B,批号190205）适量,制备6份供试品溶液,精密量取20μL 注入液相色谱仪,记录色谱图。计算得6份供试品溶液的平均含量为99.6%,RSD值为0.6%,说明该方法的重复性良好。

2.9 稳定性实验

称取盐酸氨基葡萄糖颗粒适量,用水配制成氨基葡萄糖质量浓度约为4 mg·mL-1的溶液,分别于0、2、16、37 h 测定峰面积,考察供试品溶液的稳定性。结果表明,供试品溶液在37 h内稳定。

2.10 样品测定

本实验共收集到5批盐酸氨基葡萄糖颗粒样品,精密称取各批装量差异项下样品（约相当于氨基葡萄糖200 mg）,按照2.2.3项下供试品溶液配制方法进行配制,以盐酸氨基葡萄糖对照品为外标,结果见表2。结果显示,5批样品均符合规定[本品含盐酸氨基葡萄糖（C6H13NO5·HCl）应为标示量的90.0%～110.0%]。

表2 5批样品的测定结果Tab.2 Determination results of 5 samples

3 讨论

3.1 现行标准含量测定方法存在的问题

现行质量标准均采用高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV）测定含量,企业注册标准YBH02202009采用的流动相体系为pH 2.5磷酸二氢钾溶液-乙腈（30∶70）,企业注册标准YBH00352014 采用的流动相体系为pH 7.0的磷酸氢二钾溶液-乙腈（33∶67）。2种流动相体系pH 值差异较大,pH 2.5磷酸二氢钾溶液-乙腈体系的pH 值较低,会引发氨基柱填料水解;pH 7.0的磷酸氢二钾溶液-乙腈体系无法分离氨基葡萄糖峰与其辅料蔗糖峰。本文拟采用氨基柱-HPLC-UV 法,该方法适用性较强,与柱前衍生等方法相比,操作简单且专属性较强。考虑到各企业生产的氨基柱差异较大,拟对氨基柱进行严格的筛选,最终确定以大曹三耀公司生产的氨基柱（CAPCELL PAK NH2,150 mm×4.6 mm,5μm）为分离色谱柱,以磷酸盐缓溶液（取磷酸氢二钾3.5 g,加水1 000 mL使溶解,加入0.25 mL 氨水,用磷酸调节pH 值至7.5）-乙腈（25∶75）为流动相体系,在该色谱条件下,既能实现氨基葡萄糖与其成盐离子氯离子的较好分离,又能实现盐酸氨基葡萄糖颗粒剂中氨基葡萄糖与其辅料蔗糖、乳糖和聚维酮K30 的良好分离,从而有效、准确地测定其主药成分氨基葡萄糖的含量。

3.2 色谱柱的选择

考虑到盐酸氨基葡萄糖颗粒中辅料蔗糖、乳糖和聚维酮K30对主药氨基葡萄糖的影响,在拟定的流动相体系下对4个品牌的色谱柱进行了筛选和考察。结果显示:①美国Phenomenex 公司生产的氨基柱（Luna NH2150 mm×4.6 mm,5μm）虽能较好地分离氨基葡萄糖峰与其成盐离子峰,峰形较好,但无法分离辅料蔗糖峰和氨基葡萄糖峰,调整流动相比例后仍无法分离;②纳谱分析氨基柱（250 mm×4.6 mm,5μm）分离蔗糖峰和氨基葡萄糖峰的能力较弱,且氨基葡萄糖峰与乳糖峰的保留时间相对较近,调整流动相比例后会出现氨基葡萄糖峰与乳糖峰部分重叠的情况;③Waters氨基柱（150 mm×4.6 mm,5μm）能较好地分离氨基葡萄糖峰与其成盐离子峰和辅料乳糖峰、聚维酮K30峰,但无法完全分离氨基葡萄糖峰和辅料蔗糖峰;④大曹氨基柱（CAPCELL PAK NH2,150 mm×4.6 mm,5μm）能较好地分离主峰氨基葡萄糖与其成盐离子氯离子峰,亦能较好地分离氨基葡萄糖峰与其辅料蔗糖峰、乳糖峰。在确定选用大曹三耀公司生产的氨基柱后,为了进一步提高氨基葡萄糖与蔗糖的分离度,对色谱柱的使用温度进行了筛选,在柱温30、35℃下分别进样盐酸氨基葡萄糖颗粒供试品溶液,发现在柱温为30℃时,氨基葡萄糖峰与蔗糖峰能较好分离。经实验最终确定将大曹三耀公司的氨基柱（CAPCELL PAK NH2,150 mm×4.6 mm,5μm）作为本研究的方法学色谱柱。

4 小结

盐酸氨基葡萄糖颗粒现行各质量标准收载的含量测定方法均不一致,流动相体系差异较大,且均无法分离主药氨基葡萄糖与其辅料蔗糖、乳糖等,不能有效控制药物含量。在本研究建立的含量测定条件下,盐酸氨基葡萄糖颗粒剂中的主药氨基葡萄糖与其成盐离子（Cl-）能被较好地分离,同时氨基葡萄糖与其辅料蔗糖、乳糖也能被较好地分离。结果表明,该方法专属性强、重复性好,能较好地满足相关药物生产企业的检测条件,故该含量测定方法能满足准确测定盐酸氨基葡萄糖颗粒含量的要求。该研究可为盐酸氨基葡萄糖颗粒剂或其他剂型的后续研究提供参考,为氨基葡萄糖类药物质量标准的提高提供技术支持。