藏药马钱子炮制工艺的优化及质量标准研究

马应风,多杰才让*,于永青,慕晓旭,鲁 雪

1.青海省藏医院,西宁 810007;2.藏药研发国家重点实验室,西宁 810016;3.西宁市第二人民医院,西宁 810003

马钱子为马钱科植物马钱（Strychnosnux-vomicaL.）的干燥成熟种子。冬季采收马钱的成熟果实,取出种子,晒干即为马钱子[1]。马钱子又称番木鳖[2],藏语名为“果西拉”[3]。中医临床的入药方法为冬季果实成熟后采摘,除去果肉,取出种子,晒干后炮制入药[4]。马钱子虽为藏药常用药材,但由于其具有毒性,故使其临床应用受到了一定限制[5]。藏药材的炮制与临床安全用药紧密相关,对马钱子进行炮制的主要目的是提高疗效、降低毒性。因此,明确其毒性成分或有效成分是确定炮制工艺的关键。

在藏药制剂生产中,马钱子需经炮制才能入药。据统计,在青海省藏医院300多种成方制剂中,含马钱子的制剂约占5%。马钱子具有止痛、解毒的效果,用于治疗血龙上亢、胃肠绞痛、中毒症[6]。临床上常用于气血上壅症（高血压、高血脂）的治疗。《中华藏本草》中记载马钱子具有消肿、止痛、清心热、干黄水的功效,用于治疗咽喉痹痛、风湿性关节炎、虫牙、痞块、痈疽、肿痛、血龙病、血热病[7]。《中国藏药材大全》中记载马钱子能够杀虫、去腐、干黄水、愈疮,用于治疗胃疫疠、培根瘀紫症、中毒症[8]。其在藏医药领域中的应用历史悠久、用途广泛。

关于马钱子的炮制方法,《藏药炮制技艺大全》等中记载:将马钱子放入炭火或草木灰中烫去外皮,取出,每7粒马钱子加2捧犏牛奶煮沸,煎熬至剩余五分之三后取出,弃去奶渣,用清水洗净,晾干备用。因马钱子有毒,故用于炮制马钱子的犏牛奶需掩埋[9-11]。现代研究表明,马钱子的主要有效成分为2种生物碱,其中最重要的为番木鳖碱（士的宁）和马钱子碱,这2种生物碱既是主要生物活性成分,又是主要毒性成分,基于传统的藏医药理论,采用科学、合理的炮制手段去毒,对于控制药材的不良反应,保证制剂的用药安全尤为重要。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-2030型高效液相色谱仪[四元泵、UV检测器,岛津企业管理（中国）有限公司];威立雅超纯水机（威立雅水处理技术上海有限公司）;XS-204（万分之一）、XS-205（十万分之一）电子天平,均购自梅特勒托利多仪器有限公司。

1.2 试药

生马钱子购自安徽亳州药材市场,经国医大师尼玛鉴定为马钱科马钱子属植物马钱（StrychnosnuxvomicaL.）的成熟干燥种子;马钱子总生物碱对照品（批号112030-201601,马钱子碱质量分数为45.40%,士的宁质量分数为49.9%,中国食品药品检定研究院）;乙腈（色谱纯,山东禹王和天下新材料有限公司）;水为超纯水;其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 马钱子炮制方法

2.1.1 传统马钱子炮制方法 取马钱子生品200 g,用水浸泡1 d,剥皮备用。先将犏牛奶90 g煮开后,再倒入样品30 g左右（马钱子与犏牛奶的比例约为1∶3）,武火煮沸,计时,文火微沸,至相应的时间（见表1）,取出,清洗数次,至无奶渣为止,晒干,备用。

2.1.2 优化马钱子炮制方法 取马钱子生品350 g,粗粉碎,去皮,过1 号筛备用。先加犏牛奶90 g 或180 g,煮开后,倒入样品约30 g（马钱子与犏牛奶的比例为1∶3或1∶6）,武火煮沸,计时,文火微沸,至相应的时间（见表1）,取出,清洗数次,至无奶渣为止,晒干,备用。

表1 传统马钱子炮制方法和优化马钱子炮制方法的样品信息Tab.1 Sample information of traditional Nux vomica L.processing method and optimized Nux vomica L.processing method

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称定马钱子总生物碱对照品13.01 mg,分别置于10 mL 量瓶 中,加 三氯甲烷适量使其溶解并稀释至刻度,摇匀。分别精密量取该溶液2 mL,置于同一个10 mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,即得（每1 mL含士的宁0.129 82 mg、马钱子碱0.118 12 mg）。

2.2.2 供试品溶液的制备 分别将2.1项下各时间段炮制品粉碎,过3号筛,精密称取粉末0.6 g,置于具塞锥形瓶中,加氢氧化钠溶液（取氢氧化钠4.3 g,加水定容至100 mL,即得）3 mL,混匀,放置30 min;精密加入三氯甲烷20 mL,密塞,称定质量,置于水浴中回流提取2 h,放冷,再称定质量;用三氯甲烷补足减失的质量,摇匀,分取三氯甲烷液,用铺有少量无水硫酸钠的滤纸过滤,弃去初滤液,精密量取续滤液3 mL,置于10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,经0.45μm微孔滤膜过滤,取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈-0.01 mol·L-1庚烷磺酸钠与0.02 mol·L-1磷酸二氢钾的等量混合溶液（用体积分数为10%的磷酸调节pH 值至2.8）（21∶79）为流动相;检测波长为260 nm。理论板数按士的宁峰计算应不低于5 000。

2.2.4 测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪,测定,即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性实验 按照2.2.3项下色谱条件,分别精密吸取供试品、对照品溶液各10μL,分别注入高效液相色谱仪。记录色谱图,结果见图1。由图1可见,在与对照品色谱图相应的保留时间上,有相同的色谱峰。

图1 HPLC图Fig.1 HPLC chromatograms

2.3.2 标准曲线的绘制 精密吸取混合对照品储备液（每1 mL含马钱子碱0.504 8 mg、士的宁0.554 8 mg）,按照2.2.1项下对照品溶液的制备方法制成一系列不同质量浓度的混合对照品溶液,按照2.2.3项下色谱条件测定,以质量浓度为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y）,绘制标准曲线,求得回归方程:y1=2×106x1+874.75,r=0.999 9;y2=2×106x2-228 8.2,r=0.999 9。结果表明,马钱子碱、士的宁质量浓度分别在0.031 5～0.504 8、0.034 6～0.554 8 mg·mL-1的范围内呈良好的线性关系。

2.3.3 精密度实验 按照2.2.3项下色谱条件,精密吸取马钱子总生物碱对照品溶液10μL,连续进样6次,测得马钱子碱、士的宁的RSD 值分别为1.05%、1.26%,表明仪器的精密度良好。

2.3.4 稳定性实验 取同一供试品溶液（18号）,分别在0、2、4、8、10、12、24 h测定,按照2.2.3项下色谱条件测得马钱子碱、士的宁的峰面积,计算得马钱子碱、士的宁的RSD 值分别为0.75%、1.25%,表明供试品溶液在24 h内的稳定性良好。

2.3.5 重复性实验 取同一批供试品（18号）,按照2.2.2项下方法制备6份供试品溶液,分别进样,按照2.2.3项下色谱条件测得马钱子碱、士的宁的平均含量分别为8.687 4 mg·g-1、RSD=1.45%;1.542 2 mg·g-1、RSD=1.06%,表明方法的重复性良好。

2.3.6 加样回收率实验 精密称取已知含量的供试品粉末6份,每份约0.3 g,加入对照品溶液（马钱子碱的质量浓度为0.533 3 mg·mL-1,士的宁的质量浓度为0.586 2 mg·mL-1）2、5、10 mL 按照2.2.2项下方法制备供试品溶液,按照2.2.3项下色谱条件测定,计算得马钱子碱的平均回收率为99.7%,RSD值为1.75%;士的宁的平均回收率为102.2%,RSD值为0.22%。结果见表2。

表2 回收率实验结果Tab.2 Recovery experimental results

2.3.7 传统马钱子炮制方法和优化马钱子炮制方法的样品对比含量测定 分别取马钱子各时间段炮制品,按照2.2.2项下方法制备供试品溶液,按照2.2.3项下色谱条件测定,分别吸取供试品溶液各10μL,分别注入液相色谱仪,记录峰面积,计算炮制品中马钱子碱和士的宁的含量。结果见表3。

表3 样品对比含量测定结果Tab.3 Comparison of sample content determination results

2.3.8 样品含量测定 分别取按照2.1.2项下优化马钱子炮制方法奶煮10 min的样品10份,按照2.2.2项下方法制备供试品溶液,按照2.2.3项下色谱条件测定,分别吸取供试品溶液各10μL,分别注入液相色谱仪,记录峰面积,计算炮制品中马钱子碱和士的宁的含量。结果见表4。

表4 样品含量测定结果Tab.4 Sample content determination results

3 讨论

马钱子属于剧毒类药材,中医炮制的目的主要是减毒,以扩大其治疗窗。卢军等[12]研究发现,应用砂烫法对马钱子进行炮制后,毒性成分的含量均降低,同时有效成分的含量有所升高。史磊等[13]研究发现,应用油炸法对马钱子进行炮制,温度在215～235℃时,毒性成分的含量相对降低,同时有效成分的含量有所升高。应用现代炮制方法烘焙法对马钱子进行炮制后,毒性较大的成分含量显著降低,而其他成分的含量相对稳定[14]。应用爆压法对马钱子进行炮制,其毒性物质的含量显著降低,毒性与生品马钱子相比明显降低[15-16]。潘扬等[17]研究发现,应用发酵法对马钱子进行炮制,其发酵品的半数致死量（LD50）明显升高,其毒性显著降低。传统炮制方法使马钱子毒性降低是由于士的宁和马钱子碱在加热过程中醚键断裂开环,转变成其异型结构和氮氧化合物,被转化的这些生物碱毒性变小,且保留或增强了某些生物活性,从而降低了马钱子的毒性[18-19]。而藏医传统的剥皮奶煮法和改良的粗粉碎去皮奶煮法与维吾尔医的牛奶浸渍[20-21]炮制方法原理相似,可显著降低生马钱子中士的宁的含量,可能是牛奶中的蛋白质与生物碱结合形成某种新物质并溶解于牛奶中,使得炮制品中生物碱的含量大幅下降,而这种结合必须是在一定的温度下发生,这种推断还有待深入研究[22]。

马钱子藏药炮制工艺至今仍然停留在依靠炮制人员经验控制的水平,很难控制炮制质量,批次间有效成分含量的差异大,不利于制马钱子饮片的规范化、标准化[23]。目前制定和颁布的马钱子炮制品质量标准[3]中,炮制工艺缺乏定性、定量的数据,各生产单位因炮制工艺和水平参差不齐,炮制过程难以把握（如方法不同,时间不一,火候不均等）,影响其炮制质量和制剂疗效,有必要对其炮制工艺进行系统地量化研究,确定客观、科学的炮制工艺参数,制定合理的炮制工艺规范,以利于炮制品质量标准的制定,从而保证炮制品质量的可控性。藏药炮制要与时俱进,在继承传统炮制精髓的基础上,应用现代科学理论与技术,研究炮制前、后药材的理化性质和药理作用的变化,揭示炮制提高药物疗效、降低药物不良反应的原理,以适应藏医药的发展。

本研究表明,传统藏医去皮奶煮法,去皮耗时长,耗费人力多,煮沸时间较长,调研时,煮沸时间最短为0.5 h,最长为5 h,各地藏医院炮制的时间长短不一。采购去皮马钱子,经本次对药材的鉴别预实验表明,去皮马钱子灰分超标,其水溶液呈碱性,存在用碱性物质去皮的现象,存在安全隐患。采用粗粉碎去皮的方法,能够降低人工剥皮的成本,并缩短炮制周期,采用药材与犏牛奶比例为1∶3,使药材充分浸泡于犏牛奶中,采用先加热牛奶后加药材的步骤,使药材与牛奶接触的时间可控,煮沸时间延长,有毒物质的含量下降。本研究结果能为藏医炮制马钱子确定最佳炮制工艺提供参考依据。