大黄、赤芍注射液调控JAK/STAT信号通路促进急性肝衰竭大鼠肝再生的机制研究

张荣臻，吕超，王娜，毛德文，陈月桥，柳琳琳

(1.广西中医药大学第一附属医院, 广西 南宁 530023, 2.广西中医药大学 护理学院, 广西 南宁 530023)

0 引言

急性肝衰竭(acute liver failure, ALF)是指短期内肝细胞大量死亡，并在14 d内出现Ⅱ度以上肝性脑病的临床综合征，可出现肝功能异常、黄疸、肝脏生化指标异常、凝血功能障碍等，病死率极高，28 d内病死率超过50%[1-2]。肝细胞大量凋亡坏死进而引起肝脏功能严重损伤是肝衰竭的基本病理。显而易见，能否促进肝细胞有效再生是治疗该病的着眼点。目前，肝移植是治疗肝衰竭根本办法，但因肝源不足、费用高昂、术后身体的排斥、远期存活率低下等问题，肝移植并不能被绝大多数患者所接受，内科综合治疗仍是该病当前治疗的主流。其实，肝脏自身具有极强的再生能力，在肝脏出现损伤的情况下，肝脏表现出极大的再生能力和修复潜能。目前已证实Janus蛋白酪氨酸激酶/信号转导及转录激活子(JAK/ STAT)信号通路的许多成员在肝脏中表达，参与肝再生过程。前期研究发现，大黄、赤芍注射液可以改善肝衰竭大鼠肝功能，抑制大鼠炎症因子的活化，提高大鼠的生存率，其作用机制可能与促进肝衰竭大鼠肝细胞再生相关[3]。本研究通过建立急性肝衰竭大鼠模型，探究大黄、赤芍注射液介导JAK/ STAT信号通路在该病进展中的作用及对肝再生的影响，有利于揭示ALF发病机制，寻找该病新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物

购买2月龄,质量为190～240 g(动物生产许可证号：SCXK 湘 2014-0011)120只SPF级SD雄性大鼠。饲养和实验均在广西中医药大学第一附属医院实验中心完成，动物饲养环境遵循实验中心条件，温度控制在24 ℃左右，相对湿度控制在 55%～70%，光照时间按照12 h间隔，保持充足的饲料和饮水，定期清理排泄物，适应 7 d后进行造模实验。实验方案经由广西中医药大学动物实验伦理委员会批准(批准号：201606023)。

1.2 试验药物及试剂

D-氨基半乳糖(D-Galactosamine，D-GalN)分析纯(美国Sigma公司)；脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)(美国Sigma公司)；大黄、赤芍注射液(广西中医药大学药学院制备)；促肝细胞生长素注射液(吉林敖东药业)；戊巴比妥钠注射液(北京华业寰宇化工有限公司)；Jak2 (D2E12) XP© Rabbit mAb(CST)；Phospho-Jak2 (Tyr1007/1008) Antibody(CST)；Stat3 (D1B2J) Rabbit mAb(CST)；Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP© Rabbit mAb(CST)。

1.3 动物模型制备、分组与给药

选用60%肝切除术后+20 mg/100 g D-GalN+1 μg/100 g LPS腹腔注射构建ALF大鼠模型[3]。将造模成功的大鼠随机选取100只，随机分为造模阳性对照组(对照组)、促肝细胞生长素组(生长素组)、大黄、赤芍低剂量组(低剂量组)、大黄、赤芍中剂量组(中剂量组)、大黄、赤芍高剂量组(高剂量组)，每组各20只。参照文献[4]等药理试验中动物与人体间的等效剂量换算公式，临床上成人每日大黄、赤芍的给药量为15 g/60 kg，换算出大鼠的对应给药量应为1.46 g/kg，对应注射液静脉给药量为0.005 mL/d。于实验前3 d至实验结束分别尾静脉注射给药，1次/d，间隔24 h。低剂量组予0.002 5 mL/d，中剂量组予0.005 0 mL/d，高剂量组予0.007 5 mL/d，对照组均予生理盐水0.010 0 mL/d，生长素组参照文献[4]给予0.010 0 mL/d。实验过程中，动物均饮用生理葡萄糖盐水液(内含10%葡萄糖，0.9%氯化钠)。

1.4 标本采集及处理

ALF大鼠造模成功后，分别在24、48 h 两个时间点从5组大鼠中随机各取6只存活大鼠进行采集相关组织样本。大鼠经1%戊巴比妥钠(质量比为40 mg/kg) 腹腔注射麻醉后固定在手术台，碘伏消毒后铺无菌孔巾，正中腹部切开，把肝组织进行分离，并取每只大鼠肝左叶相同部位采集组织病理标本，并用 10%中性甲醛固定后备用， HE 染色后在光镜下观察肝组织的病理改变，其余肝脏组织放置在液氮中保存再转至-80 ℃冰箱冻存备 RT-PCR 及 WB 检测。

1.5 研究指标检测

1.5.1 RT-PCR 检测肝组织JAK2、JAK3、STAT3、STAT2蛋白表达

使用 Trizol(Invitrogen，15596-026)提取肝组织总 RNA，取 5 μL RNA用1%琼脂糖凝胶进行电泳，以检测 RNA 的完整性，使用 TIANScript RT KIT(KR104-02)进行反转录，实验操作按产品说明书进行。完成后进行PCR反 应，采用 SuperReal PreMix Plus SYBR Green(天根生物，FP205)试剂盒，构建20 μL反应体系[2×SuperReal PreMix Plus 10 μL ，上下游引物(10 μmol/L)各 0.6 μL，cDNA 100 ng，50×ROX Reference Dye△ 0.4 μL，RNase-Free dd H2O至 20 μL]。反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 15 min；58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 个循环。绘制溶解曲线，最终数据以2-△△ct计算进行分析，检测基因引物序列见表1。

表1 检测基因引物序列Tab.1 Sequence table of gene primers

1.5.2 WB检测肝组织JAK2、JAK3、STAT3、STAT2蛋白表达

提取肝细胞胞质总蛋白，使用 ELX-800 型酶标仪进行蛋白质定量，SDS-PAGE 电泳，电泳结束后，用含有5%脱脂奶粉的 TBST 封闭，2 h 后加入JAK2、JAK3、STAT3、STAT2兔抗鼠多克隆一抗(1∶1 000)4 ℃封闭过夜，第二天去除一抗，TBST 洗PVDF膜3次，每次5 min，再加入辣根过氧化物 酶标记羊抗兔二抗(1∶4 000)，37 ℃孵育1 h，TBST 洗PVDF膜3 次，每次5 min。将ECL试剂中增强液与稳定的过氧化物酶溶液按1∶1比例混匀，滴加工作液于PVDF膜上，反应30 min，待荧光带明显后，用滤纸吸去多余的底物液，置于GE AI600进行显影检测。使用NIH Image J软件分析灰度值，计算各目的条带灰度值与内参基因tublin灰度值之间的比值。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠一般情况观察

各组大鼠在造模后4～6 h后苏醒，苏醒后的大鼠表现出精神萎靡、行动迟缓、嗜睡等症状。12 h内只有对照组1只大鼠死亡，其他组无死亡大鼠出现。药物干预组的大鼠在总体精神状态上表现较对照组好。(中、高)剂量组的大鼠有腹泻现象，可能与大黄、赤芍剂量有关。

2.2 qPCR检测结果

2.2.1 各组大鼠造模后24、48 h的JAK2与JAK3基因qPCR检测结果

各组大鼠的造模后24、48 h的JAK2和JAK3的qPCR检测结果见表2，mRNA相对表达量如图1所示。

表2 各组大鼠的造模后24、48 h的JAK2和JAK3的qPCR检测结果Tab.2 qPCR detection results of JAK2 and JAK3 at 24 h and 48 h after modeling in each group

图1 各组大鼠24、48 h JAK2/JAK3 mRNA相对表达量Fig. 1 Relative expression of JAK2 / JAK3 mRNA at 24 h and 48 h in each group

JAK2：造模后24 h，(低、中、高)剂量组、生长素组的qPCR检测结果均明显高于对照组，具有统计学差异(P<0.05)，3个中药干预组组间无明显差异。造模后48 h， 4个药物干预组的结果均明显高于对照组，具有统计学差异(P<0.05)，3个中药干预组组间无明显差异。同一组48 h相比24 h，JAK2检测结果都有显著提高(P<0.05)。上述结果表明3个剂量的大黄、赤芍与促肝细胞生长素均能上调肝细胞的JAK2基因表达。

JAK3：造模后24 h，低剂量组与生长素组的JAK3R的qPCR检测结果明显高于对照组(P<0.05)，其他两组无明显差异。3个中药干预组随着剂量增加，JAK3表达下调，且组间相比，低剂量组明显高于(中、高)剂量组(P<0.05)，中剂量组高于高剂量组(P<0.05)。造模后48 h，低剂量组与促肝细胞生长素组的检测结果明显高于对照组(P<0.05)，3个中药干预组随着剂量增加，JAK3表达下调，且组间相比低剂量组明显高于(中、高)剂量组(P<0.05)，中剂量组高于高剂量组(P<0.05)。同一组48 h的JAK3检测结果相比24 h都有明显提高(P<0.05)。上述结果表明低剂量的大黄、赤芍与促肝细胞生长素均能够上调JAK3的基因表达，但(中、高)剂量并不能影响JAK3基因表达水平。

2.2.2 各组大鼠造模后24、48 h的STAT2与STAT3基因qPCR检测结果

各组大鼠的造模后24、48 h的STAT2和STAT3的qPCR检测结果见表3，mRNA相对表达量如图2所示。

表3 各组大鼠的造模后24、48 h的STAT2和STAT3的qPCR检测结果Tab.3 qPCR detection results of STAT2 and STAT3 at 24 h and 48 h after modeling in each group

图2 各组大鼠24、48 h STAT2/STAT3 mRNA相对表达量Fig. 2 Relative expression of STAT2 / STAT3 mRNA at 24 h and 48 h in each group

STAT2:造模后24 h,4个药物干预组的检测结果均高于对照组(P<0.05)。3个中药干预组组间相互比较，剂量越低，检测结果越高，且低剂量组明显高于高剂量组(P<0.05)。造模后48 h，3个药物干预组的检测结果均高于对照组(P<0.05)，3个中药干预组组间相互比较，剂量越低，检测结果越高，但无统计学差异。同一组造模后48 h的STAT2检测结果均明显高于24 h(P<0.05)。上述结果表明3个剂量的大黄、赤芍与促肝细胞生长素在24、48 h均能上调STAT2基因表达水平，且中药剂量越低上调水平越高。

STAT3:造模后24 h，(低、中)剂量组与生长素组的检测结果高于对照组(P<0.05)。3个中药干预组组间相互比较，剂量越低检测结果越高，低剂量组的结果明显高于(中、高)剂量组(P<0.05)。造模后48 h，(低、中)剂量组与细胞生长素组的检测结果均高于对照组(P<0.05)。3个中药干预组组间相互比较，剂量越低，检测结果越高，低剂量组的结果明显高于(中、高)剂量组(P<0.05)。同一组造模后48 h的STAT3基因检测结果均明显高于24 h(P<0.05)。上述结果表明(低、中)剂量的大黄、赤芍与生长素都能够在24、48 h上调STAT3基因表达水平，且中药剂量越低上调水平越高。

2.3 Western blot结果

2.3.1 各组大鼠造模后24、48 h的JAK2/JAK3蛋白表达情况

各组大鼠的造模后24、48 h的JAK2、JAK3的Western blot检测结果见表4，Western blot染色结果见图3。各组大鼠的蛋白灰度值与内参tublin相比得到表达的比值，造模后24 h，JAK2蛋白表达药物干预组均高于对照组，48 h各组的JAK2表达均明显提高，且药物干预组均明显高于对照组。造模后24 h，JAK3蛋白表达低剂量组与生长素组明显高于对照组，(中、高)剂量组与对照组无明显差别，48 h各组的JAK3表达均明显提高，(低、中)剂量组、生长素组均明显高于对照组。上述结果表明大黄、赤芍与促肝细胞生长素能够促进JAK2/JAK3蛋白的表达，且低剂量组表达水平更高。

表4 各组大鼠的造模后24、48 h的JAK2、JAK3的Western blot检测结果Tab.4 WB detection results of JAK2 /JAK3 of rats in each group at 24 h and 48 h after modeling

2.3.2 各组大鼠造模后24 h、48 hSTAT2/STAT3蛋白表达情况

各组大鼠的造模后24、48h的STAT2/STAT3的Western blot检测结果见表5，Western blot染色结果如图4所示。

各组大鼠的蛋白灰度值与内参tublin相比得到表达的比值，造模后24 h，各药物干预组大鼠的STAT2蛋白表达均明显高于对照组，中药组之间无明显差异。造模后48 h，各组STAT2大表达水平均明显高于24 h，且药物干预组明显高于对照组，(低、中)剂量组高于高剂量组。造模后24 h，各低剂量组和生长素组的STAT3蛋白表达高于对照组，且低剂量组明显高于(中、高)剂量组的表达。各组造模后48 hSTAT3表达水平均比造模后24 h明显提高，且药物干预组明显高于对照组，低剂量组明显高于中、高剂量组。上述结果表明大黄和、赤芍与促肝细胞生长素均能够促进STAT2/STAT3蛋白的表达，且低剂量组表达水平更高。

表5 各组大鼠的造模后24、48 h的STAT2/STAT3的Western blot检测结果Tab.5 Western blot detection results of STAT2/STAT3 of rats in each group at 24 h and 48 h after modeling

3 讨论与小结

急性肝衰竭是短期内肝细胞大量坏死为主要病理特点的严重肝病，病情重，预后差，8周内病死率高达80%[5]。其病情变化复杂，涉及直接损伤和间接损伤等多种因素，目前学者比较认可以免疫炎症损伤为核心、肝脏微循环障碍和内毒素血症介导的肝衰竭“三重打击学说”[6]。在乙肝病毒、酒精、药物或其他毒物等对肝细胞首次打击的基础上，过度的免疫炎症反应导致微血管的栓塞及肝血窦的结构破坏，缺血缺氧以及缺血再灌注损伤 (ischemia-reperfusion injury，IR) ，缺血缺氧以及IR诱导大量的线粒体途径凋亡，产生的氧自由基、炎症因子等造成的肝细胞的二重打击；大量的炎症因子通过肠源性内毒素介导的“内毒素→巨噬细胞→细胞因子风暴”核心机制，产生过度、持久的免疫炎症反应，对肝脏造成三重打击，最终导致了肝衰竭的发生[7]。肝细胞的死亡与再生的不平衡是肝衰竭死亡的重要原因。

JAK-STAT信号通路是近年来发现的一条与肝细胞增殖、分化、凋亡、细胞信号传导密切相关的信号通路，可以调控肝细胞再生。JAK接受上游受体分子的信号后，迅速募集于受体上并发生活化，激活质膜胞浆侧与其联系的JAK激酶，激活JAK激酶磷酸化受体，募集STAT分子，JAK激酶磷酸化STAT分子并进入胞核，诱导相关基因的表达以改变靶细胞的增殖或分化状态[8-11]。炎症因子可通过JAK-STAT途径介导过度的炎症反应来加重肝损伤从而促进肝衰竭发生。文献[12-13]通过实验发现肝衰竭患者体内pSTAT3表达增加，认为mTOR可诱导白介素6(IL-6)/STAT3通路增强患者的辅助性T淋巴细胞17反应，从而产生更强的炎症刺激加重肝衰竭发生。蓝颖等[14]研究发现通过调控JAK2/STAT3通路相关蛋白的表达可以减少炎症因子的释放和细胞凋亡，从而有效地改善肝损伤。研究表明，通过调控JAK2/STAT3通路可有效拮抗内毒素引起的急性肝衰竭，进一步减少肝细胞损伤并提高存活率[15-16]。研究发现，血管生成是组织生长的重要过程，对于肝脏再生也是必不可少的[17]，IR损伤是肝脏再生过程中较为严重的并发症，直接影响肝再生的效果，血管内皮细胞的急性炎症反应是其主要原因[18]。在肝脏再生过程中，通过调控JAK / STAT3信号通路可以下调血管紧张素原及血管紧张素Ⅱ的表达，预防肝脏再生过程中血管紧张素Ⅱ相关的缺血再灌注损伤，有效促进肝细胞再生，拮抗急性肝衰竭[19]。另有研究表明，调控JAK / STAT3信号通路可以减轻肝细胞线粒体DNA损伤，减少肝细胞凋亡、坏死，拮抗急性肝衰竭[20]。

急性肝衰竭可归属于祖国医学中“急黄”的范畴，其核心病机为湿热之毒瘀结于内，阻滞血脉，弥漫三焦，前期研究认为“毒邪为肝衰竭的致病之因，贯穿疾病的始终；痰、瘀为本，毒、痰、瘀互为因果”[21]，治疗当以清热解毒、祛瘀生新为法。大黄清热泄下、畅阳明谷道，令毒邪从二阴而出；赤芍入血分，除血痹，祛瘀生新。两药合用，以利湿与泄热相伍，使二便通利，前后分消，湿热得行，瘀热得下，则黄疸自退。前期研究显示大黄、赤芍注射液可以有效调控急性肝衰竭大鼠血清炎症因子的水平，促进肝细胞再生，提高肝衰竭大鼠的存活率[22]。现代药理学研究表明，大黄可以通过促进肝细胞增殖分化、降低肝细胞凋亡、抑制炎症反应等过程，促进肝细胞再生，拮抗ALF进程[23-24]。赤芍中含有大量单萜苷，赤芍总苷是其主要有效成分，芍药苷可通过降低肝组织炎症因子的含量及增加谷胱甘肽含量而避免肝氧化损伤，以达到保护肝细胞拮抗肝衰竭的目的[25-26]。

本研究通过采用大黄、赤芍注射液治疗急性肝衰竭大鼠，并采用qPCR、Western blot 等实验方法验证了大黄、赤芍注射液能够上调JAK2/JAK3、STAT2/STAT3蛋白表达，活化JAK/STAT信号通路，促进肝细胞再生，其中低剂量组的各项检测结果优于(中、高)剂量组，但其作用机制尚未明确。前期研究显示大黄、赤芍注射液可以有效调控急性肝衰竭大鼠血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-6等炎症因子的水平，促进肝细胞再生[22]。研究表明TNF-α及IL-6可共同启动肝脏再生，激活G0期肝细胞[27]。LPS、C3a、C5a、ICAM(细胞间黏附分子)作用于库普弗细胞产生TNF-α，促进IL-6 mRNA合成，然后，IL-6、TNF-α被释放，与邻近肝细胞表面受体结合，触发GP130的活动，从而激活JAK，导致STAT3和MAPK途径的激活，STAT3途径的激活能触发36%的立早基因表达，从而使细胞开始增殖，启动细胞循环，因此猜测是造模后释放的TNF-α及IL-6等炎症因子水平已经远超正常诱导再生的剂量水平，大黄、赤芍注射液能够降低炎症因子水平，同时将炎症因子水平下降到一定的水平，活化JAK/STAT信号通路以发挥诱导肝细胞再生的作用。该假设有待于进一步的研究证实。